Во время развития мозга млекопитающих аксоны формируют сложные отростки, иннервирующие специфические клетки-мишени. В периферической и центральной нервных системах аксоны имеют раннюю фазу быстрого роста, за которой следует зависимая от активности фаза прунинга (pruning - обрезка) (1-8). Однако представление о том, что аксоны развиваются способом последовательного «роста и обрезания» остается противоречивым (9), поскольку аксоны могут подвергаться одновременно и росту и прунингу (10-12) или монотонному росту (13). Time-lapse in vivo изображение было единственным способом понять, каким образом происходит рост аксона и его усложнение у низших позвоночных (14,15). У млекопитающих же исследования на развивающемся мозге осуществлялись, главным образом, на наблюдениях препаратов фиксированного мозг. Именно поэтому было известно относительно немного о том, как развиваются проекции аксонов в пределах своих регионов-мишеней на уровне одного кортикального слоя или колонки, а также о точном времени роста аксона. Совсем немного известно и о развитии аксонных ветвлений у интернейронов.

Рост аксона, его направленность и разветвление – это ключевые элементы развития аксона. Эти процессы довольно хорошо были изучены в культуре клеток. Развитие аксона включает удлинение его дистального конца и образование новых отростков ветвления. Верхушка растущего аксона представляет собой конус роста со множеством филоподий (16,17). Предполагали, что ростовой конус является крайне важным элементом для выбора направления роста аксона, которое может осуществляться посредством контактного или химического ориентира. (18). Например, морфология отдельного конуса роста может варьировать в соответствии с тем, растет ли аксон быстро вдоль своего пути или находится в состоянии остановки в точке, в которой принимает дальнейшее решение (19-23). Не исключено, что разные ростовые программы для разного типа аксонов связаны с различиями строения конуса роста, поэтому точная роль ростового конуса в ветвлении является также предметом дискуссии (22, 24). Несмотря на предполагаемую роль ростового конуса в ветвлении некоторых аксонов (25,26), в некоторых случаях промежуточное ветвление, независимое от конуса роста, играет также важную роль в усложнении аксона (27). 

Прунинг (обрезка) – другой важный признак развития аксона. Эти два процесса описаны для развивающихся нейронов разных видов животных. У Drosophila аксоны нейронов грибовидного тела элиминируются во время метаморфоза путем дегенерации (28) – процесса, напоминающего дегенерацию Wallerian (Уоллеровская дегенерация) (29,30). В гиппокампе мышей такое усечение аксонов, вероятно, осуществляется с помощью ретракции (втягивания) кончика аксона (31, 32). 

Для исследования роста аксона и его прунинга в интактном мозге авторы использовали двухфотонную микроскопию при изучении трансгенных мышей, экспрессирующих связанный с мембраной зеленый флуоресцентный белок (green fluorescent protein -GFP) под thy-1 промотером (34). Было получено изображение растущего аксона в слое 1 коры во время раннего постнатального развития. Сравнивали проекции аксонов таламокортикальных нейронов ( ТС) с локальными аксонами интернейронов Кахаля-Ретциуса (Cajal-Retzius - CR). ТС аксоны начинали прорастать в кору примерно во время рождения мышат и формировали отростки в течение последующих 2-3 недель (13, 35-39). Авторы получили изображение аксонов таламических нейронов, посылающих свои проекции в бочонковое (barrel ) поле коры. Особое внимание обращалось на вторичные (диффузные) таламические проекции (40-43), происходящие из Pom (медиальной части заднего ядра таламуса). Их мишенями являются слой 5А и супрагранулярные слои, включая слой 1 (44,45). В отличие от них, первичные таламические проекции из вентральной постериомедиальной (ventral posteromedial -VPm) области вентробазального ядра таламуса направлены в слои 4 и 5В сенсорной коры и не проецируются в слой 1 (13). Отдельные Pom аксоны проецируются шире VPm аксонов и их целями являются комплементарные области. Pom аксоны охватывают множественные бочонковые колонки в первичной соматосенсорной коре и часто посылают отростки в сенсорные области более высокого порядка, а также в двигательные области коры (44, 45). Предполагают, что диффузные таламические проекции опосредуют сенсорно-моторную интеграцию и таламокортикальную синхронность (43). 

CR нейроны появляются относительно рано во время эмбрионального развития (примерно на Е10-Е14), но их аксоны все еще продолжают расти во время первых двух недель постнатальной жизни, что доказывается присутствием ростового конуса на кончике аксона (47,48). Клеточные тела, дендриты и аксоны CR нейронов находятся в пределах слоя 1. Таким образом, CR клетки являются самыми ранними кортикальными интернейронами (49). Предполагают, что из-за своего стратегического положения в слое 1 CR нейроны важны для миграции нейронов и образования кортикальных слоев по схеме «изнутри-кнаружи» (46). Действительно, CR нейроны секретируют белок Reelin, который играет основную роль в появлении слоев коры мозга (50,51). CR аксоны образуют синапсы главным образом на растущих апикальных дендритных ветвях пирамидных клеток (46). Подобно кортикальным интернейронам во взрослом мозге CR нейроны функционируют как активные элементы в ранней кортикальной сети благодаря синаптической активности развивающихся пирамидных нейронов (46,48). Авторы показали, что TC и CR аксоны почти одновременно обнаруживают выраженный рост аксона и его прекращение с небольшим сдвигом в сторону роста. TC и CR аксоны разными способами усложняют свою структуру. Динамика структурирования аксона была более выражена у ТС аксонов. Верхушки ТС аксонов имели слабовыраженные конусы роста, росли быстро и в прямом направлении. В отличие от них CR аксоны имели крупные конусы роста, росли медленно, а их траектория роста была достаточно извилиста. У ТС аксонов наблюдали также заметное ветвление аксонов, усиливающееся во время развития. После раннего периода ветвления CR аксоны усложняются во время роста в отсутствие ветвления. 

Основные результаты исследования

Авторы представили результаты исследования развития арборизации (ветвления) ТС и CR аксонов в кортикальном слое 1 на основании проведенного ими долгосрочного слежения in vivo за этими аксонами. 

Изображение таламокортикальных аксонов и аксонов клеток Кахаля-Ретциуса (Cajal-Retzius) in vivo

Была найдена трансгенная линия (L21) мышей экспрессирующих GFP в двух типах кортикальных аксонов (34). Эти мыши экспрессировали GFP в небольшой подгруппе ТС проецирующих нейронов из VPm и Pom областей. Из этих полей аксоны проецировались в бочонковое поле коры. GFP экспрессировался также и в некоторых клетках Кахаля-Ретциуса – локальных внутрикорковых интернейронах слоя 1 (Рис. S1). Pom проекции имеют коллатерали в слое 1 (44,45). Небольшое число других нейронов также экспрессировали GFR во время первых двух недель постнатального развития (например, пирамидные нейроны гиппокампа), но они не проецировались в соматосенсорную кору. Т.о. кортикальные аксоны в пределах слоя 1 предположительно принадлежат либо к CR клеткам, либо к нейронам таламокортикальных проекций. Уровень GFR экспрессии был достаточным для высококонтрастного in vivo двухфотонного изображения отдельных аксонов в наружных слоях коры, начиная примерно с 3-го постнатального дня развития (Р3) и впоследствии этот уровень увеличивался (РИС.1). 

Аксоны были идентифицированы как CR аксоны, если они делали поворот обратно к клеточному телу CR клетки в слое 1 (РИС.1е и 1f). Эти клетки можно было распознать и по морфологическим особенностям (48). Их дендритные деревья характеризуются тонкими ветвями, ориентированными вертикально по отношению к pia mater (РИС. 1G-1I). Более того, CR аксоны имели особый паттерн ветвления с последовательным раздвоением, слегка смещенным вдоль дорсовентралной оси, с дочерними сегментами, направленными в противоположную сторону параллельно поверхности pia и всегда в пределах слоя 1 (РИС. 1G). ТС тела оказались лежащими слишком глубоко для наблюдений in vivo. Предполагаемые отростки ТС нейронов в слое 1 конвергировали в единый ствол, который возникал глубоко в коре (на глубине более 300 мкм ниже pia). Группа (n=5) предполагаемых ТС аксонов была позже реконструирована в фиксированном мозге после его перфузии при использовании en-bloc imaging and slicing (BREBIS) (РИС. S2). Такая реконструкция позволила обнаружить, что ТС аксоны проходят через белое вещество, что согласуется с их таламическим происхождением. В некоторых образцах (n=3) было прослежено направление этих аксонов к таламусу (РИС. 1A-1D). Морфология реконструированных аксонов с обильным ветвлением в слоях 1А и 5А соответствовала морфологии реконструкции Pom таламических аксонов (44). 

Конус роста аксонов

Структура конуса роста аксона может варьировать в зависимости от расположения растущего аксона (22,23). В участках, исследованных авторами, (РИС.2A;VIDEO S1), к их удивлению обнаружилось, что ТС и CR аксоны отличаются по структуре конусов роста. Ростовые конусы ТС аксонов состояли из небольших утолщений (вздутий), часто не имеющих четких филоподий. И, напротив, во время первой недели постнатального развития верхушки CR аксонов имели крупные, сложно устроенные ростовые конусы, усеянные множеством филоподий (РИС.2B;VIDEO S2). На стадии P5-P6 они были в четыре раза крупнее ростовых конусов ТС аксонов (123.0 мкм 2 по сравнению с 32.9 мкм2, p<0.001. РИС.2С). Число филоподий на один ростовой конус был выше в CR аксонах по сравнению с ТС аксонами (4.45 и 0.97 соотв., р< 0.0001; РИС. 2D). Ростовые конус, принадлежащие ТС и CR аксонам часто наблюдали в одних и тех же областях, в нескольких микрометрах друг от друга. Предполагают, что их структурные различия не продиктованы средой. Такие различия в морфологии ростовых конусов между ТС и CR сохранялись в течение первой недели постнатального развития. Когда ветвь, принадлежащая либо к ТС, либо к CR аксону прекращает рост (или когда происходит ретракция), ростовой конус можно не обнаружить на верхушке аксона. Т.о., частота крупных ростовых конусов на CR аксонах снижается с возрастом, а после Р9 они встречаются крайне редко. Крупные ростовые конусы, подобные наблюдаемым в CR аксонах, никогда не встречались в ответвлениях ТС аксонов внутри наружных кортикальных слоев (РИС.2Е). 

Траектории аксонов

Авторы проанализировали траектории путей ТС и CR аксонов. ТС росли относительно прямо (РИС.3А), CR ростовые конусы имели извилистую траекторию (РИС.3В). Крупные ростовые конусы часто кратковременно расщеплялись на два и более отдельных ростовых конуса (РИС.S3A). Однако такое расщепление не сохранялось, а вело к резкому изменению траектории роста аксона. Различия в траекториях ТС и CR аксонов сохранялись на всех стадиях (РИС.3С и 3D). Индекс «извилистости» был наиболее высоким для CR клеток на стадии P8 и Р13. Извилистость аксонов у ТС клеток отчасти увеличивалась с возрастом из-за присоединения коротких и довольно запутанных ветвей. Следует заметить, что поздние ответвления не имели ростовых конусов и это заставляет думать, что различия между CR и ТС ростом аксонов не обусловлены хронологическим возрастом ответвлений. Неодинаковость траекторий аксонов указанных клеток предполагает различия в механизмах управления этими типами нейронов. Извилистость пути CR аксонов свидетельствует о тесном взаимодействии с локальными «ориентирами» и спецификой на уровне траектории аксонов (52). 

Рост аксона и его ретракция (втягивание)

Действительно ли прунинг аксонов следует за периодом быстрого роста (12,53)? Авторы попытались выяснить, действительно ли “прунинг” in vivo происходит в области мишени аксона и если это так, то происходит ли это одновременно или последовательно по отношению к периоду роста (РИС.4). Отличается ли скорость роста у СR и ТС аксонов, и что стоит за разной морфологии конусов роста (21-23)? Изображение ростовых конусов ТС и CR аксонов просматривали через 10-30 часов во время постнанального развития на стадиях Р4-Р19. Некоторые верхушки аксонов продвигались за это время на значительное расстояние, другие подвергались ретракции (РИС. 4А, см также РИС.S4A, S4B). Отдельные аксоны одновременно обнаруживали рост и ретракцию на кончиках разных ветвей. Никаких заметных морфологических ориентиров, которые позволили бы предсказать поведение аксонов, обнаружено не было. Концы ТС аксонов росли или ретрагировали с высокой скоростью – до 35 мкм в час (РИС. 4С). Доля растущих аксонов (65%) и ретрагирующих аксонов (35%) была сходной для CR и ТС клеток в разных возрастах. В первую неделю постнатального развития быстрый рост и ретракцию наблюдали на большинстве кончиков разветвлений, но после Р12 верхушки аксонов росли или втягивались только на короткие дистанции (РИС.4D, см также 4С). В среднем, рост почти уравновешивался ретракцией (РИС.4Е). Общий сетевой рост верхушек аксонов был выше у ТС аксонов, чем у CR в каждой исследованной временной точке. 

Два типа «обрезки» (pruning): дегенерация аксонов как составная часть нормального развития.

Прунинг аксонов является одним из существенных признаков развития аксона. Авторы наблюдали два типа аксональной обрезки. Кроме ретракции верхушек аксонов, обрезка может происходить посредством дегенерации крупных участков ствола аксона (РИС.4 и 5). Дегенерация начинается с появления выпуклости на стволе аксона, которая позже отделяется от родительского древа (РИС. S4B). Дегенерированные аксонные древа позже дезинтегрируются на небольшие фрагменты (РИС.5С), весь процесс занимает менее 12 часов. Эти осколки затем исчезают в течении 24-48 часов, предположительно после очищения глией. Процесс отличается от ретракции, при которой не остается флуоресцирующих осколков (РИС.S4D). Невозможно прогнозировать дегенерацию, на основании морфологии аксона. Дегенерация аксонов часто распространяется на всю видимую аксональную ветвь одного нейрона (РИС.5). Однако дегенерация обычно огранивалась одним аксоном в поле зрения в отличие от ретракции, которая поражала терминали ветвей множества соседних аксонов. Возможно, что дегенерация аксона присуща определенному аксону, а не является реакцией аксонов на внешний сигнал. Чтобы прояснить вопрос о патологичности аксональной дегенерации, возникающей после хирургического вмешательства или in vivo изображения, автора анализировали препараты мозга, фиксированного после перфузии у обычных мышей. В мозге контрольных животных дегенерация аксонов также определялась, причем в том же возрасте и с той же частотой (РИС.5Е), указывая на то, что дегенерация аксонов является нормальным явлением во время развития. Дегенерация аксонов встречалась относительно редко (менее чем у 5 % GFR-позитивных аксонов). Её наблюдали только на ранних стадиях постнатального развития (Р4-Р9) и у ТС, но не у CR аксонов. Обычно дегенерации подвергаются длинные участки ТС аксонов с множественным ветвлением. Иногда весь ТС ствол, который рос в течение нескольких дней в слой 1, внезапно дегенерировал на всем пути ниже глубоких слоев коры, что и наблюдали авторы (РИС.5А). Сегменты аксонов, подвергнувшиеся дегенерации были всегда крупнее сегментов, подвергшихся ретракции. Их средний размер составлял 782.3 ± 134.7 мкм (дегенерирующие аксоны) и 80.6 ± 10.1 (аксоны, подвергшиеся ретракции) на стадии Р5-Р9 (p<0.0001; РИС 5D). Позже во многих случаях весь аксон в поле зрения был фрагментированным. Следовательно, дегенерация представляет собой механизм элиминации аксона, отличающийся от ретракции и оперирующий с более длинными фрагментами аксонов. 

Ветвление аксона

Предполагают, что формирование ветвей осуществляется одним из трех возможных механизмов: расщеплением ростового конуса, задержкой ветвления ростового конуса и интерстициальным (независимым от ростового конуса) ветвлением (18, 22, 24). Каким же образом происходит ветвление аксонов in vivo? 

Авторы наблюдали формирование промежуточных ветвей у ТС и CR аксонов (РИС.6) У ТС аксонов небольшие ростовые конусы появляются de novo из основного ствола (РИС.S3B) и затем элонгируют ортогонально по отношению к родительскому аксону. У CR аксонов новые ростовые конусы также появляются из исходного ствола (неопубликованные данные) и затем быстро элонгируют и приобретают свою типичную крупную конфигурацию. Ростовые конусы CR аксонов (но не ТС аксонов) нередко разделяются на два и более сегмента, но никогда не образуют два постоянных дочерних ответвления (РИС S3A). Это означает, что во время развития аксона в пределах области его мишени промежуточное ветвление является основной формой ветвления аксона в неокортексе. Однако расположение новых ветвей в развивающемся стволе отличается у ТС и CR аксонов. Промежуточное ветвление у ТС аксонов происходит равномерно вдоль основных сегментов аксона (РИС.6А и 7А). Новые ветви у CR аксонов появляются ближе к заднему (предыдущему) ведущему ростовому конусу (РИС.6В и 7В). Из 69 новых ветвей ТС аксонов только 11 (16%) появлялось в 100 мкм от терминали в сравнении с 19 (56%) из 34 новых ветвей, образовавшихся у CR аксонов той же локализации (p<0.005; РИС.7С). 

Возможности изобразить одни и те же аксоны за 2-х недельный период позволило авторам определить последовательность развития аксонов. Такое долговременное наблюдение показало выраженные различия между ТС и CR аксонами. Во время первой недели постнатального развития многие ТС аксоны сначала состояли из очень небольшого числа (1-3) длинных ветвей, распространяющихся в прямом направлении на сотни микрон в слой 1 коры без вторичного ветвления (РИС.7А, РИС.2А и 6А). В течение следующих нескольких дней появлялись короткие ответвления вдоль этих родительских аксонов с высокой скоростью (от 2,2 веточек на мм аксона в день на стадии P5-P7 до 2,8 на стадии Р8-Р11. РИС. 7D). Многие из этих ранних ответвлений были нестабильными и имели короткую продолжительность жизни, однако во время второй постнатальной недели жизни вновь образованные ответвления стабилизировались. Таким образом, между P5–P6 и P14–P19 плотность ответвлений (т.е. число ветвей на мм аксона) увеличивалась почти в три раза. 

Во время первой сессии наблюдений, примерно на стадии Р5, CR аксоны уже имели многочисленные (более 10) ответвления, расположенные около тела клетки и большинство их верхушек еще находилось в стадии роста (РИС.7В и РИС. 2В и 6В). Во время первой постнатальной недели жизни ответвления появлялись с низкой скоростью (1,3 веточек на мм аксона в сутки), которая снижалась по мере развития (РИС.7D). Темп прибавления ответвлений у CR аксонов на всех стадиях постнатального развития был ниже чем у ТС аксонов (p<0.05). Т.к. основной формой роста CR аксона было удлинение верхушки аксона без ветвления, плотность ветвления снижалась между P5–P6 и P14–P19 от 3.6 ± 0.6 точек ветвления на мм на стадии P5–P6 до 2.7 ± 0.6 на стадии P14–P19 (p = 0.4). Различия в плотности ветвления между ТС и CR аксонами во время постнатального развития были статистически значимыми (p<0.05). Во время третьей недели постнатального развития ТС аксоны менялись незначительно, терминали CR аксонов подвергались слабой ретракции. CR нейроны и их аксоны становились менее яркими, главным образом, из-за снижения экспрессии GFR и постепенно становились незаметными. 

Обсуждение

Арборизация аксонов является критическим этапом при образовании нейронных сетей. Чтобы выявить способы усложнения и роста аксонов, авторы получили изображения проекций ТС нейронов и CR интернейронов, начиная с раннего постнатального периода до момента созревания отростков во время третьей недели постнатальной жизни мышей. Эти аксоны перекрещивались в слое 1 коры и играли роль идентичную внеклеточным влияниям. Авторы нашли, что развитие CR и ТС аксонов основывалось на тонком балансе роста и прунинга («обрезки»). ТС и CR аксоны имели разную структуру и разную динамику развития, подтверждая тем самым , что разные типы нейронов используют разные, присущие лишь им, программы развития для иннервации своих клеток-мишеней. Кроме того, данные авторов крайне важны для разрешения противоречий, касающихся способов обрезки аксонов и их ветвления. 

В слое 1 коры ТС аксоны имеют небольшие ростовые конусы и растут в основном прямо, тогда как CR аксоны имеют крупные ростовые конусы, движущиеся извилистым путем. Предполагали, что развитие ростовых конусов необходимо для управления ростом аксона, основанном на контактах (22). Ранее считали, что извилистый путь может свидетельствовать о взаимодействие между ростовыми конусами и локальными, направляющими движение, ориентирами (52). Однако находки авторов показали, что ТС аксоны в действительности могут использовать локальную среду и почти не зависеть от локальных ориентиров, тогда как формирование CR аксонов существенно зависит от таких сигналов. 

Рост аксонов и их обрезка являются важными этапами развития нервной системы. На основании наблюдений фиксированных аксонов (4-7) предполагали, что за ранним бурным ростом аксонов следует их обрезка (54). Но был описан и постепенный рост и обрезка аксонов, особенно у низших позвоночных, например, у головастиков Xenopus [10,14,15]. Авторы изучили рост и обрезку аксонов в пределах области-мишени кортикальных аксонов млекопитающих количественно и обнаружили, что рост верхушек ответвлений и ретракция может происходить одновременно. Рост и обрезка оказались почти сбалансированным процессом с некоторым сдвигом в сторону роста (РИС.4Е). В результате, общий размер аксонных ответвлений увеличивался постепенно с возрастом до третьей недели постнатального развития. 

Авторы также наблюдали две разных формы обрезки аксонов: ретракцию (втягивание) верхушки ответвления и дегенерацию ответвлений аксона. Ретракция встречается и у ТС, и у CR аксонов. Относительно небольшие сегменты ветвей (десятки микрометров) втягивались, не оставляя никаких видимых «обломков» (РИС.4). Дегенерацию аксонов наблюдали только у ответвлений ТС аксонов, в результате которой элиминировались крупные участки (сотни микрометров) ответвлений аксона (РИС.5). Дегенерация не происходила последовательно в одном направлении (например, дистально-проксимально), а поражала весь аксон синхронно. Это напоминало Уоллеровское перерождение перерезанного нерва, когда неожиданно происходит масштабная фрагментация всего аксона (несколько сотен микрон) в течение нескольких минут (30). Процесс дегенерации ТС аксонов происходит путем образования «вздутий» (beading ) и затем посредством фрагментации, также напоминающей Уоллеровское перерождение. Сходные формы обрезки аксонов наблюдали у нейронов грибовидного тела Drosophila (28) и в культивируемых аксонах гиппокампа (32). В экспериментах авторов дегенерация аксонов не являлась патологическим явлением. Во-первых, дегенерирующие аксоны были видны только во время определенного периода времени (Р4-Р9), подтверждая тем самым, что это процесс регулируемый развитием. Во-вторых, дегенерация аксонов появляется в разное время после window surgery (до 3-х дней). В третьих, лишь малая часть аксонов (менее 5%) подвергалась такому типу обрезки. И, наконец, фрагментированные аксоны были обнаружены в контроле на препаратах мозга мышей после перфузии в том же возрасте, что и у опытных животных (РИС.5А). Маловероятно также, что дегенерация ТС аксонов обусловлена апоптозом нейронов в таламусе. Волна естественной клеточной гибели в таламусе происходит в основном до рождения мышат (55-57). Более того, подавление активности каспазы не предотвращает Уоллеровской дегенерацию или прунинг в аксонах нейронов грибовидного тела у Drosophila (28, 58). 

Дегенерация аксонов и ретракция верхушек ответвлений в аксонах коры отличается от axosome shedding ( шеддинг от английского "shed" - терять) в нейромышечных соединениях (59). При axosome шеддинге происходит утрата органелл мемебраны по мере втягивания аксона. А дегенерация аксона происходит синхронно вдоль длинных сегментов аксонов. Ретракция аксонов не вовлекает ретракционные луковицы (bulbs) (видимые при axosome shedding) и при ней не наблюдают фрагментированных осколков, даже когда изображение регистрировали c короткими интервалами (Рис. S4D). Axosome шеддинг может, следовательно, представлять третий механизм обрезки в периферической нервной системе. Во время развития ретракция аксонов и их дегенерация, вероятно, играют разные роли при образовании связей в неокортексе. Ретракция видимо вовлечена в локальную «очистку» внутри области-мишени, тогда как дегенерация оперирует на уровне проекций. Было бы интересно определить связь между дегенерацией аксонов в развивающихся ТС аксонах мышей и в нейронах грибовидного тела у Drosophila. Важно также выяснить механизмы, управляющие сохранением (а не ретракцией) ответвлений ТС и CR аксонов, включая роль нейрональной активности и синаптогенеза. 

Ветвление аксонов

Эксперименты на спинном и головном мjзге показали, что многие аксоны имеют ответвления в интерстициальных сайтах на всем протяжении родительского ствола (27,60). Однако противоречия, касающиеся роли ростовых конусов в ветвлении, остаются (18), т.к. некоторые аксоны, как оказалось, используют расщепление ростового конуса для ветвления (25). Ростовые конусы CR аксонов часто временно расщепляются на две ветви, но одна из этих ветвей постепенно подвергается ретракции. Расщепленный ростовой конус, следовательно, никогда не даст две истинных дочерних ветви. Time lapse изображение отдельных CR ростовых конусов подтверждает, что расщепление ростового конуса может участвовать в поведении аксона – в управлении его направления и поворота (РИС. S3A). Данные авторов показали, что подавляющее большинство ответвлений формируется в промежуточных участках (РИС.6), что не согласуется с прямой ролью расщепления ростового конуса в формировании ветвей. 

Ростовые конусы также вовлечены в промежуточное ветвление (24). Описано 2 типа такого ветвления. Эксперименты в диссоциированных культурах кортикальных нейронов показали, что ростовые конусы могут появляться позади участков нестабильного цитоскелета, что позднее становится точками ветвления благодаря процессу, известному как «задержка интерстициального ветвления» (26). В других случаях интерстициальные ответвления появляются через несколько дней после того, как основной аксон прекращает свой рост (24). Было найдено, что у ТС аксонов все ответвления появляются вдоль основного ствола аксона, что несовместимо с задержкой интерстициального ветвления. У CR аксонов, напротив, ветви добавляются ближе к растущим верхушкам, подтверждая, что процесс сходный с задержкой интерстициального ветвления может наблюдаться у CR нейронов in vivo. Однако авторы не наблюдали филоподий или ламелларных обрывков, которые бы оставались позади продвигающегося ростового конуса, как описано было ранее при задержке интерстициального ветвления (26). 

Разные способы усложнения ТС и CR аксонов

Функции сетей в зрелом мозге основаны на точной сетевой схеме. Физическая организация аксонных и дендритных отростков является структурной основой функциональных сетей. Развитие аксонов включает как внутренние программы, так и внешние факторы, включая ориентиры-направители и активность нейронов (10, 11, 61). Из-за того, что аксоны разных типов клеток молекулярно отличны, они, скорее всего, и реагируют по разному на внешние ориентиры и растут разными путями. Time-lapse изображение показало, что ТС и CR аксоны развиваются по разному в течение 2-х недель постнатального развития (РИС.S5. Video S3 и S4). ТC аксоны растут по прямой и подвергаются ретракции быстро. С возрастом они усложняются – к их основному стволу добавляются многочисленные ответвления. CR аксоны растут и подвергаются ретракции медленнее. Их усложнение в постнатальном мозге осуществляется с помощью элонгации терминалей по непрямому пути с незначительным промежуточным ветвлением. 

Некоторые из этих различий в поведении между CR и ТС аксонами были обусловлены разностью их временем развития. К примеру, многие из CR ответвлений появлялись до первой сессии наблюдения, т.е. тогда, когда большинство ТС ветвлений в слое 1 еще не встречались. CR и ТС нейроны появляются примерно на одной и той же эмбриональной стадии (36,48), и на изучаемых авторами стадиях CR аксоны еще имели много крупных ростовых конусов и росли довольно длительный период во время наблюдения. По этой причине различия в структуре ростовых конусов, траектории аксонов и скорости роста между этими двумя типами клеток не могут быть отнесены к различиям в созревании между CR и ТС аксонами. 

Структура аксонов зависит от типа клетки. Например, аксоны кортикальных пирамидных клеток имеют прямой путь, а аксоны кортикальных ингибиторных нейронов – извилистый (62,63). Данные авторов показали, что эти различия сохраняются и для проекций ТС нейронов, и для аксонов CR интернейронов. Вычислительный анализ позже показал, что проекции аксонов нейронов делают столько же контактов с синаптически не связанными дендритами, сколько и со связанными дендритами (52,64). Однако интернейроны имеют больше контактов со своими постсинаптическими партнерами в сравнении с другими нейронами, расположенными по соседству. Разные способы усложнения, наблюдаемые авторами для ТС и CR аксонов, согласуются с этими наблюдениями. ТС аксоны характеризуются масштабным ростом в прямом направлении и ретракцией, подтверждая, что эти аксоны могут быть стабилизированы посредством зависимой от активности селекции (10). CR аксоны усложняются постепенно, траектория их извилиста, т.е. на эти аксоны влияют внеклеточные ориентиры, управляющие их ростом. 

Усложнение аксонов и критические периоды

Добавление новых ответвлений (РИС.7В), степень роста и ретракции отдельных терминалей ТС аксонов (РИС. 4 D) снижались после второй постнатальной недели жизни мышей, подтверждая тем самым, что аксонное древо достигает зрелого состояния примерно в эти сроки. Интересно то, что конец второй недели постнатального развития совпадает с концом критического периода бочонкового поля коры. Во время этого критического периода слой 2/3 сенсорной карты (layer 2/3 sensory maps )(65, 66) и сети (67) демонстрируют быстрое развитие и формирование пластичности. Более того, созревание ветвления дендритов (68) и подвижность шипиков (65) слоя 2/3 пирамидных нейронов также нарушается при сенсорной депривации. Вероятно, что локальный рост аксонов и прунинг вносят свой вклад в основанное на опыте развитие кортикальных сетей. Действительно, перестройки таламокортикальных колатералей аксона, зависимые от активности, обнаруживали in vitro (11, 69). Остается установить, влияют ли на развитие аксонов манипуляции, нарушающие сенсорный опыт, например подстригание вибрисс у животных. 

РИС.1S. GFP Expression Pattern in L21 Transgenic Mice 

РИС.2S.Methods 

РИС.3S. Tortuous Path of CR Axon Growth Cone and Interstitial Branching in TC Axon 

РИС.4S.Examples of Growth, Branch Retraction, and Axonal Degeneration 

РИС.5S. Summary Cartoon of the Different Modes of Axon Elaboration Used by Local Intracortical Axons (CR) and Long-Range Extracortical Axons (TC) 

РИС.6S. Density of Branch Points in Imaged Mice Matches That in Control Mice 

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Animals and surgery All experimental protocols were conducted according to the National Institutes of Health guidelines for animal research and were approved by the Institutional Animal Care and Use Committee at Cold Spring Harbor Laboratory. We used male and female c57/Bl6 transgenic mice in which a thy1 promoter drove the expression of GFP that was targeted to the cell membrane via a palmytoylated site (mGFP, line L21 [34]). Throughout the first 2 wk of postnatal development, these mice express GFP in Cajal-Retzius neurons, thalamic neurons in the Pom and VPm nuclei, and in CA1 pyramidal neurons in hippocampus. Importantly, cortical pyramidal neurons begin to express GFP only toward the end of the second postnatal week (with the exception of a small number of pyramidal neurons in the cingulate cortex). At P3–P12, mice were deeply anesthetized with an isoflurane-oxygen mixture delivered by an anesthesia regulator (SurgiVet, Waukesha, Wisconsin, United States) or with an intraperitoneal injection of a mixture of ketamine (0.13 mg/g body weight) and xylazine (0.01 mg/g). Following a midline scalp incision, the skull overlying the right somatosensory and visual cortices was carefully removed, leaving the dura intact. The dura was covered by a thin layer of 1.2% low-melting-point agarose (Type IIIA, Sigma, St. Louis, Missouri, United States) dissolved in Hepes-buffered artificial cerebrospinal fluid, and then a custom-made round cover glass (No. 1) was quickly laid over the agarose. This “window” (see РИС.2SA) was sealed in place with dental cement. A titanium bar was also attached to the skull to later secure the mouse to the stage of the microscope. Between imaging sessions mice were housed with littermates and their mothers. The surgery itself seemed innocuous to the mice, as they recovered nicely from the surgeries and anesthesia, gained weight, and behaved indistinguishably from their unoperated littermates.