Свободнорадикальная теория старения

"Успехи геронтологии", 2000г., выпуск 4. cc.271-272

Реферат НИИ Медицины труда. Москва

     Старение можно себе представить как процесс непрерывного разрушения, присущий всем объектам живой и неживой природы, следствие второго начала термодинамики, а организм - как открытую термодинамическую систему, рассеивающую свое тепло и одновременно потребляющую извне свободную энергию высокого потенциала световую или химическую. Существование и поддержание сложных диссипативных структур живых организмов возможно благодаря постоянному потоку энергии, а также непрерывному воспроизведению не устаревающей генетической информации и структур в процессе клеточного деления. Возрастные изменения в соматических клетках многоклеточных организмов обусловлены снижением пролиферативного потенциала и свободнорадикальными реакциями, основным источником которых является восстановление кислорода осуществляемое митохондриями, микросомами и НАДФ H - оксидантными системами фагоцитов и других специализированных клеток. Величина потока активных форм кислорода связана с интенсивностью основного обмена. Накопление повреждений в клетках и скорость старения зависят от соотношения процессов образования активных форм кислорода и их обезвреживания ферментативной системой антиокислительной защиты. Причиной неизбежного возникновения, утечки и рассеивания активных форм кислорода при преобразованиях энергии в митохондриях является второй закон термодинамики, исключающий 100% эффективность такого рода процессов. Сопоставление удельной активности супероксиддисмутазы в гранулоцитах, тромбоцитах, эритроцитах и лимфоцитах человека со способностью этих клеток к экзогенной генерации супероксидных радикалов позволило проследить взаимосвязь указанных факторов со сроком жизни клеток в крови, который варьирует от 12 часов до нескольких лет. 

     Возникшая около сорока лет назад и ведущая свое происхождение из радиационной биологии свободнорадикальная теория старения, в последнее десятилетие быстро становиться главным направлением исследований, способным раскрыть первичные биохимические механизмы, лежащие в основе старения. Долгое время находившаяся в дремотном состоянии гипотеза Д. Хармана [ 37] получила мощный импульс для развития после открытия в 1969 году Мк Кордом и Фридовичем супероксиддисмутазы [ 48 ]. Благодаря этому открытию были не только получены неопровержимые доказательства образования в живых клетках интермедиатов одноэлектронного восстановления кислорода, но и заново проанализирована и прояснена роль сложной, многоуровневой системы антиокислительной защиты. Постоянно расширяя области своего приложения свободнорадикальная теория старения органично включает многие из ранее выдвинутых гипотез и теорий старения. Закономерно она может быть увязана с современной термодинамикой, определяющей развитие и эволюцию сложных живых и неживых систем [ 8, 9 ]. В настоящей работе мы попытались коснуться некоторых наиболее интересных аспектов этой быстро развивающейся области исследований и проследить, как эта теория согласуется с общей системой взглядов или парадигмой современной геронтологии.

СТАРЕНИЕ - УСТУПКА ЭНТРОПИИ
     Геронтология - одна из наиболее сложных и запутанных областей биологической науки, несомненно, находится на завершающем этапе накопления фактического материала необходимого для глубоких теоретических обобщений. Ее прогресс тесно связан с решением фундаментальных проблем и глубоким проникновением в суть молекулярных механизмов функционирования живых систем. В то же время достаточно сказать, что сама попытка дать научное определение жизни встречает глубокие трудности и не исключено, что граница, отделяющая живое от неживого носит весьма условный характер. Многие из бесчисленных теорий старения, выдвинутых ранее, представляют уже только исторический интерес, другие же отражая ряд существенных сторон процесса могут быть уложены в логическую схему более универсального общего механизма старения. Поскольку старение со всей очевидностью носит столь сложный всеобщий характер и не знает исключений, рассмотрение следует начать с фундаментальных физических законов. Немецкий физик Р. Клаузис в 1865 году ввёл в научный оборот понятие энтропии, как меры естественной склонности тепловой энергии к рассеиванию (диссипации).
Самопроизвольно увеличение энтропии было признано фундаментальным законом естествознания - вторым началом термодинамики. Он постулирует наличие в природе асимметрии, то есть однонаправленности всех происходящих в ней процессов. Физические законы обратимы во времени, но там, где присутствует энтропия, появляется необратимость. Энтропия имеет по существу двойной физический смысл : как мера обесценивания любой энергии и как показатель неумолимо растущего хаоса, особого термодинамического состояния, которое гораздо более вероятно, чем существование упорядоченных структур. Для создания и существования любой структуры, как некой неоднородности необходим приток энергии извне. С этой точки зрения старение, или процесс непрерывного разрушения присущ всем объектам как живой, так и неживой природы. Будучи открытыми термодинамическими системами, живые организмы поглощают свободную энергию высокого потенциала (световую или химическую) и в то же время активно рассеивают энергию поставляя энтропию в мировое пространство. Это позволяет поддерживать термодинамическое равновесие структур с окружающей средой и их относительную стабильность (гомеостаз). Некоторой аналогией может служить турбулентность или вихри, которые могут возникать только в потоке. Закономерности развития открытых термодинамических систем описываются нелинейной термодинамикой, основы которой были заложены выдающимся бельгийским учёным И. Пригожиным [ 14, 16 ]. Избыток свободной энергии, поглощенный открытой системой может привести к ее самоусложнению. Это самоусложнение и самоорганизация всего лишь обеспечивают процесс оптимально экономичного рассеивания подводимой энергии системой. Всеобщее нарастание энтропии и хаоса во Вселенной в итоге сопровождаются образованием все более сложных диссипативных структур и накоплением информации, как меры случайного выбора. Математически это описывается как процесс, обратный увеличению энтропии. [ 17 ] . Согласно математическим выкладкам Д. фон Неймана существует определённый порог сложности системы, ниже которого она не может воспроизводить себе подобных. Определение Б. М. Медникова жизнью называет активное, идущее с затратой энергии поддержание и воспроизведение специфических структур [ 13 ], что, собственно, и является постоянной борьбой со старением. Эта формулировка, по нашему мнению не является исчерпывающей. Интересно определение жизни, как апериодического кристалла Э. Шредингера, а также определения, подчеркивающие энергетический аспект жизни - противостояние энтропийным процессам [2 ]. Борьба с энтропией возможна, по-видимому, благодаря существованию не устаревающей генетической программы, которая многократно переписывается и передается последующим поколениям. Живой организм всегда является единством генотипа и фенотипа. Его можно сравнить с книгой, которая постоянно переиздается. Бумага, на которой она написана, может износиться и истлеть, но содержание её вечно.

БЕССМЕРТИЕ И СТАРЕНИЕ НА КЛЕТОЧНОМ УРОВНЕ : ВОЗМОЖНОЕ УЧАСТИЕ СВОБОДНЫХ РАДИКАЛОВ
     Действительно, вопрос о наличие процессов старения у постоянно делящихся клеток, например, бактерий, до сих пор остается дискуссионным, несмотря на то, что был поставлен еще в прошлом столетии. Согласно основным положениям, постулированным А. Вейсманом, естественное старение отсутствует у одноклеточных организмов. Эволюционное противоречие между необходимостью специализации клеток и сохранением их бессмертия путем неограниченного деления привело к необходимости разделения клеток на соматические, которым было позволено дифференцироваться и стареть, и бессмертные зародышевые или половые [1]. Существование огромных и сложных многоклеточных организмов, содержащих многие триллионы соматических клеток, в сущности, направлено к тому, чтобы обеспечить бессмертие половых клеток. Взгляды Вейсмана нашли убедительное подтверждение в исследованиях Л. Хейфлика, установившего, что нормальные соматические клетки человека имеют ограниченный митотический потенциал и конечную продолжительность жизни [ 18 ]. Естественное старение, как представляется очевидным, присуще и бесконечно делящимся клеткам, но, постоянно воспроизводя свою генетическую информацию и свои сравнительно несложные структуры, они умеют делать его незаметным. Старение же многоклеточного организма складывается из падения пролиферативного потенциала его стволовых клеток и старения и смерти его полностью дифференцированных клеток. Этот сложнейший системный процесс, ход которого определяется взаимодействием различных клеточных групп, безусловно, не следует упрощать. Различия во времени жизни каждого из этих клеточных ансамблей, как делящихся, так и уже неделящихся клеток, могут быть огромными. Фибробласты человека не успевают исчерпать лимит Хейфлика за время его жизни, тогда, как нейроны у взрослых не пролиферируют. Принципиальное значение имеет, однако, сам факт ограниченности митотического потенциала для любой нормальной соматической клетки многоклеточного организма, и не так существенно, какая из клеточных групп имеет критическое значение для продолжительности жизни индивидуума или особи. Самостоятельное значение, возможно, имеет само снижение пролиферативной активности после прохождения определенного числа клеточных удвоений, а также сохраняемая у нормальных клеток способность к восприятию действия агентов регулирующих скорость деления. Конечная длительность жизни клеточных штаммов, до некоторой степени, отражает процесс старения in vivo, а многие изменения, наблюдаемые при их старении, сходны с теми, что имеют место в тканях. В пользу репликативной теории старения приводятся данные о наличие корреляции между продолжительностью жизни разных видов животных и сроком жизни их клеток in vitro [ 25, 28 ]
Незначительное число делений проходят клетки больных прогерией ( синдром Вернера ). Имеется, однако, работа, в которой сведения об обратной корреляции между репликативным потенциалом клеток и возрастом их доноров оспорены [ 57 ]. К настоящему времени уже многое известно о механизмах, с помощью которых соматические клетки ограничивают число своих делений. Находит подтверждение гипотеза А. Оловникова о роли укорочения теломерной ДНК в этом процессе [ 15, 21, 28 ] и, что весьма примечательно, уже на этой стадии существенное влияние на скорость старения оказывают свободнорадикальные процессы. Условия гипероксии резко сокращают продолжительность жизни длительно пассируемых клеток и стимулируют накопление в них характерного пигмента старения липофусцина [ 39, 56 ]. Экспозиция фибробластов в 40% кислороде приводит к повреждению и быстрой потере теломерной ДНК [ 79, 80 ]. Напротив, низкое парциальное давление кислорода увеличивает продолжительность их жизни in vitro [ 27, 84]. Антиоксидант добавленный в среду инкубации способен продлевать жизнь культуры фибробластов в зависимости от дозы [ 27 ]. Вопрос об участии активные форм кислорода в регуляции деления, дифференцировки, старения клеток и механизмах канцерогенеза уже давно дискутируется в литературе [ 6, 9, 51 ]. Недавние исследование показало, что онкогенный ras ген индуцирует генерацию оксидантов в клетке [ 41 ]. Постоянное повреждение генома оксидантами, как предполагается, может быть ответственно за превращение клеточных структур в бессмертные клеточные линии [ 51 ]. Закономерности клеточного старения удобно рассмотреть на примере высокоспециализированных клеток периферической крови, не способных к делению или делящихся достаточно редко. Срок жизни клеток крови человека варьирует в очень широких пределах от нескольких часов до нескольких лет ( табл. 1 ). Нами было установлено, что уровень удельной активности супероксиддисмутазы в различных форменных элементах крови сильно различается [ 3 ]. Сопоставление обеспеченности клеток крови супероксиддисмутазой с их способностью к экзогенной генерации супероксидных радикалов позволило проследить взаимосвязь указанных факторов со сроком жизни клеток в крови [ 4, 5, 8, 9 ]. Самая низкая активность супероксиддисмутазы наблюдается в гранулоцитах. В то же время эти клетки обладают способностью к мощной экзогенной генерации супероксидных радикалов, с помощью которых осуществляется бактерицидная функция [ 59 ]. Для этой цели расходуется большая часть кислорода потребляемого гранулоцитами. Неудивительно поэтому, что срок жизни этих клеток невелик. Стимуляция фагоцитоза, сопровождающаяся респираторным взрывом и резким усилением генерации супероксидных радикалов, в той же степени ускоряют и гибель фагоцитов [ 59 ]. Экзогенная супероксиддисмутаза увеличивает при этом выживаемость фагоцитирующих клеток до уровня отдыхающих. Наиболее высокой активностью супероксиддисмутазы обладают тромбоциты, которые, однако, экзогенно генерируют супероксидные радикалы [ 33 ], что существенно ограничивает срок их жизни. Эритроциты также характеризуются высоким уровнем супероксиддисмутазы. Эти клетки обладают очень слабой способностью к экзогенной генерации супероксидных радикалов [ 60 ], но содержат большое количество гемоглобина, постоянно взаимодействующего с кислородом и генерирующим при автоокислении в метгемоглобин супероксидные радикалы. Срок их жизни больше чем у тромбоцитов, но не очень высокий. Лимфоциты экзогенно не генерируют супероксидные радикалы [ 42 ] и имеют довольно высокий уровень супероксиддисмутазы. Вероятно, поэтому срок их жизни весьма длителен.

Зависимость между активностью супероксиддисмутазы в форменных элементах крови человека, их способностью к экзогенной генерации супероксидных радикалов и сроком жизни клеток крови

Клетки	Активность супероксиддисмутазы	Способность к экзогенной	Срок жизни клеток в
Гранулоцит	0,13+(-)0,04	Сильная	12-14ч
Тромбоциты	1,90+(-)0,25	Слабая	7-14 сут
Эритроциты	1,3+(-)0,22	Очень слабая	100-120сут
Лимфоциты	0,56+(-)0,02	----------	Годы

ИНТЕРМЕДИАТЫ ОДНОЭЛЕКТРОННОГО ВОССТАНОВЛЕНИЯ КИСЛОРОДА В СТАРЕНИИ МНОГОКЛЕТОЧНЫХ И ГЕРОПРОТЕКТОРНОЕ ЗНАЧЕНИЕ ФЕРМЕНТОВ АНТИОКИСЛИТЕЛЬНОЙ ЗАЩИТЫ
     Идентификация в биологических системах интермедиатов одноэлектронного восстановления кислорода, а также выяснение молекулярных механизмов токсического действия кислорода позволили И. Фридовичу рассмотреть старение как следствие токсического действия кислорода [ 43 ]. Недавние исследования вновь подтвердили рост мух и червя нематоды в атмосфере чистого кислорода значительно уменьшает их среднюю максимальную продолжительность жизни и усиливает накопление карбонильных белков. Низкая концентрация кислорода наоборот увеличивает продолжительность жизни этих животных [ 40, 67, 69 ]. К сожалению, указанный метод невозможно применить на млекопитающих вследствие, явной патологии наступающей у них в условиях гипо и гипероксии. Использование супероксиддисмутазы как инструмента позволило локализовать субклеточные центры генерации супероксидных радикалов и установить, что их главным источником являются митохондрии. Тем самым нашло подтверждение одно из положений гипотезы Д. Хармана, назвавшего митохондрии ''молекулярными часами'' клеток [ 38 ]. В митохондриях метаболизируется более 90% потребляемого аэробными клетками кислорода [ 26 ] и образуется около 75% общего потока супероксидных радикалов в клетке [ 24]. Увеличение потребления кислорода ускоряет и скорость генерации интермедиатов одноэлектронного восстановления кислорода. Митохондрии у видов с низкой продолжительностью жизни, например у комнатных мух, генерируют в 6 - 300 раз больше оксидантов, чем митохондрии млекопитающих [ 64 ]. Сравнительное исследование в тканях сердечной мышцы у восьми видов млекопитающих, значительно различающихся по продолжительности жизни, обнаружило большее образование супероксидных радикалов субмитохондриальными частицами короткоживущих видов. У мыши, крысы, кролика, свиньи и коровы уровень генерации супероксидных радикалов в зависимости от продолжительности жизни различается в 6 раз [ 62 ]. В летательных мышцах слепней уровень генерации супероксидных радикалов был в 24 раза выше, чем у коровы. Аналогичные различия наблюдаются между близкородственными коротко и долгоживущими видами мух и мышей [ 68, 73 ]. При старении животных скорость генерации супероксидных радикалов и перекиси водорода митохондриями увеличивается как у насекомых, так и в мозге, сердце и печени млекопитающих [ 63, 65, 66, 70, 72, 82 ]. Предполагается, что причина связана с окислительным повреждением мембран самих митохондрий. Указанный процесс может быть успешно смоделирован. Так, скорость генерации возрастает после длительного ( 5 дневного ) содержания комнатных мух в чистом кислороде, после рентгеновского облучения выделенных митохондрий, их инкубации с химическими агентами стимулирующими генерацию радикалов [ 65, 69, 37 ] . Причиной возникновения, утечки и рассеивания интермедиатов одноэлектронного восстановления кислорода при преобразованиях энергии в митохондриях является, по-видимому, второй закон термодинамики, исключающий 100% эффективность такого рода процессов. Коэффициент полезного действия любой реальной тепловой машины не может достигать 100% . Какая-то часть энергии неизбежно рассеивается. Она уноситься либо излучением тепла, либо высокоэнергетическими частицами, каковыми и являются активные формы кислорода. Саморазгоняющееся усиление генерации активных форм кислорода митохондриями в процессе старения, с этой точки зрения, может быть объяснено снижением коэффициента полезного действия при их постепенном разрушении интермедиатами одноэлектронного восстановления кислорода. Описанные выше достижения позволили естественно и неразрывно связать свободнорадикальную теорию старения с энергетическим правилом поверхности - теорией старения ещё в 1908 году выдвинутой немецким физиологом М. Рубнером [ 58 ], который первым обратил внимание на то, что крупные млекопитающие живут дольше, чем мелкие. Например, мышь живёт 3,5 года, собака - 20 лет, лошадь - 46, слон 70. Он объяснил это разной интенсивностью обмена веществ. Суммарная затрата энергии у разных млекопитающих в течение жизни примерно одинакова - 200 ккал на 1 грамм массы. По мнению Рубнера, каждый вид способен переработать лишь определённое количество энергии - исчерпав её он погибает. Интенсивность обмена и общее потребление кислорода определяются, главным образом, условиями теплового баланса и зависят от размеров и поверхности тела. Масса возрастает пропорционально линейным размерам, взятым в кубе, а площадь в квадрате. Слону для поддержания своей температуры тела необходимо гораздо меньше энергии, такому же по весу количеству мышей - общая поверхность всех этих мышей будет значительно больше, чем у слона. Поэтому слон может позволить себе гораздо более низкий уровень обмена веществ, чем мышь. Высокий расход энергии у мыши приводит к тому, что она быстрее исчерпывает отведённые ей энергетические ресурсы, чем слон, и срок её жизни намного короче. Таким образом, существует обратная зависимость между интенсивностью обмена у животного и продолжительностью его жизни. Малая масса тела и высокий обмен веществ обуславливают небольшую продолжительность жизни. Хотя открытая Рубнером корреляция между массой тела и продолжительностью жизни животного не может не вызывать удивления, значение этого факта и его связь с процессом старения всегда оставались спорными. В значительной степени это связано с тем, что указанная корреляция является лишь приблизительной. Исключением из этого правила оказываются, например, приматы и птицы. Суммарная затрата энергии у человека на протяжении жизни на единицу массы и реальная продолжительность жизни в четыре раза превышают расчётные из энергетического правила поверхности. Большая продолжительность жизни у высокоинтеллектуальных животных обусловлена чрезвычайно длительным периодом обучения или необходимостью внегенетической передачи информации с помощью знаковой системы [ 11 ]. Непосредственное измерение потока внутриклеточно генерируемых супероксидных радикалов весьма затруднительно осуществить в естественных условиях. Однако, учитывая, что 02- является продуктом многочисленных ферментативных и не ферментативных реакций, протекающих в клетке, можно предположить, что количество генерируемых супероксидных радикалов, как и количество их избежавших элиминации супероксиддисмутазой, находиться в прямой связи с уровнем потребления кислорода и интенсивностью основного обмена. Благодаря введению поправки на обеспеченность организма ключевым ферментом антиокислительной защиты супероксиддисмутазой американский геронтолог Р. Катлер и его сотрудники получили полную корреляцию между уровнем потребления кислорода на единицу массы и продолжительностью жизни тринадцати видов млекопитающих включая человека [ 77 ]. Как видно из таблицы 2, отношение удельной активности супероксиддисмутазы в печени, мозге и сердце к интенсивности основного обмена непрерывно возрастает с увеличением максимальной продолжительности жизни и имеет строго линейный характер. Коэффициент корреляции близок к единице. Виды, имеющие более высокий уровень суммарной затраты энергии и более длительную продолжительность жизни, чем позволяет им их масса, в том числе человек, тамарин и лемур, имеют более высокий уровень супероксиддисмутазы в их органах. Низкие значения суммарной затраты энергии у мыши и гориллы соответствуют низкому уровню супероксиддисмутазы в их органах. Положительная корреляция между уровнем активности супероксиддисмутазы в мозге и продолжительностью жизни 11 видов млекопитающих была выявлена Оно и Окада [ 52 ]. Наличие определённой взаимосвязи между продолжительностью жизни млекопитающих, способностью сибмитохондриальных частиц к генерации супероксидных радикалов может быть отмечена также в работе [ 62 ]. Сравнение же млекопитающих с таким отдалённым классом, как птицы обнаруживает, казалось бы, удивительный парадокс. Продолжительность жизни птиц также как и у млекопитающих увеличивается с увеличением размера. Однако птицы живут почти вдвое дольше, чем млекопитающие того же размера [ 19 ]. В то же время, у птиц не только гораздо более высокая интенсивность обмена, но и более низкий уровень антиоксидантов. Нет, однако, никаких оснований предполагать, что генерация оксидантов митохондриями жестко и напрямую связана с интенсивностью основного обмена. Митохондрии разных видов животных и даже разных тканей метаболизируя одинаковое количество кислорода могут иметь разную скорость генерации оксидантов. Иначе говоря, различаться по степени совершенства или коэффициенту полезного действия [ 68, 73 ]. Как выяснилось в результате независимых исследований, изолированные митохондрии мозга, печени и сердца голубя потребляя в два - три раза больше кислорода, чем митохондрии крыс, генерируют только одну треть или половину перекиси водорода. Десятикратно более низкий процент конвертации кислорода в супероксидные радикалы и перекись водорода митохондриями голубя коррелирует с десятикратно более длительной продолжительностью жизни его по сравнению с крысой [ 22, 44 ]. Среди многочисленных центров генерации интермедиатов одноэлектронного восстановления кислорода, помимо митохондриального электронного транспорта, наиболее значимыми для процесса старения представляются функционирование микросомальных Р.- 450 ферментных оксидаз [ 10, 35 ], осуществляющих метаболизм ксенобиотиков, а также фагоцитирующие клетки, кислородзависимая бактерицидная система которых один из наиболее мощных источников активных форм кислорода [ 50 ].

Зависимость между максимальной видовой продолжительностью жизни, интенсивностью основного обмена и удельной активностью супероксиддисмутазы в печени, мозге и сердце