Планария — модельный объект для изучения регенерации у многоклеточных

Автор: Елена Наймарк

Schmidtea mediterranea — один из видов плоских червей планарий, ставших объектом интереснейших исследований по механизмам регенерации. Фото с сайта rna-seqblog.com

Исследование стволовых клеток плоского червя планарии позволило ученым из MIT доказать, что некоторые клетки взрослого червя, так называемые необласты, сохраняют плюрипотентность. Иными словами, они способны давать генерации любых типов клеток, а не только клеток определенного типа ткани. У всех остальных групп животных плюрипотентными бывают только клетки ранних зародышевых стадий, но никак не взрослых организмов. Экспериментально было показано, что животное может полностью регенерировать, имея лишь одну живую стволовую клетку. Кроме того, продолжается расшифровка генетических каскадов, определяющих передне-заднюю полярность тела планарии. По всей видимости, эти регуляторные каскады являются одними из самых базовых механизмов формирования тела многоклеточных животных.

Регенерация — восстановление утерянных или поврежденных тканей — одна из важнейших функций тканей многоклеточных организмов, будь то беспозвоночное животное или человек. Естественно, для людей гораздо важнее уяснить, как происходит регенерация в тканях человека — ведь это путь к быстрому заживлению ран или даже реконструированию утраченных участков тех или иных тканей или органов. Однако до массового практического использования этих важнейших в медицинском отношении сведений еще далеко. Пока же ученые пытаются выстроить механизм — генетический и физиологический — регенерации тканей. И наилучшим образом здесь подходят простейшие модельные организмы, такие как плоские черви планарии. Давно известна их поистине фантастическая способность к восстановлению тела даже из небольшого оставшегося кусочка (здесь можно посмотреть превосходные картинки по регенерации планарий).

Именно планарии и стали объектом нового исследования механизмов регенерации. Под руководством Питера Реддиена (Peter Reddien) из Массачусетского технологического института (MIT, Кембридж, США) были выполнены два взаимодополняющих исследования. Первое посвящено динамике деления так называемых необластов — клеток, из которых у планарии формируются все остальные типы клеток и которые сохраняют способность к делению на протяжении всей жизни червя. То есть необласты можно рассматривать как аналог стволовых клеток. В другой работе разобран процесс регенерации переднего и заднего концов тела планарии. Здесь акцент сделан на биохимических механизмах, регулирующих «решение» ткани, какой из концов тела отращивать — хвост или голову. Нужно отметить, что в мире животных с отращиванием новых хвостов справляются многие группы животных, а вот с отращиванием головы — почти никто. Так что планария в этом отношении — выдающийся гений.

Итак, необласты. В теле планарии имеется около 30 различных типов клеток, составляющие энто- экто- и мезодерму; необласты — лишь один из них.

Анатомическое строение планарии. Рисунок с сайта www.geochembio.com

Необласты распределены более или менее равномерно по всему телу, несколько больше их сконцентрировано в переднем конце тела впереди глотки. Перед исследователями стоял вопрос: являются ли необласты плюрипотентными или мультипотентными. Первое означает способность генерировать любые типы клеток, второе — только клетки того или иного органа или ткани. Так, клетки бластулы являются плюрипотентными — из них формируется весь организм со всеми своими специализированными клетками; а клетки, например, костного мозга — мультипотентными. Из них формируются все различные клетки крови, но не других тканей. Если необласты — это пример плюрипотентных клеток, функционирующих на протяжении всей жизни взрослого животного, то планария превращается в объект первостепенной важности для изучения всех вопросов, связанных со стволовыми клетками, — своего рода муха дрозофила или E. coli для науки о стволовых клетках. Если же необласты — это мультипотентные клетки, то планария — всего лишь один из удобных, но весьма многочисленных объектов для исследования биологии развития. Ученым удалось доказать, что необласты — это всё же плюрипотентные клетки, сохраняющие способность к любой дифференциации на протяжении взрослой жизни.

Чтобы это доказать, ученые отслеживали динамику деления необластов после облучения смертельными дозами ионизирующей радиации. Клетки необластов и только они экспрессируют ген smedwi-1 (Schmidtea mediterranea — таково название планарии, взятой исследователями, и первые буквы гена, работающего в необластах, повторяют начальные буквы видового и родового названия); чтобы «увидеть» клетки необластов, ученые отмечали продукты экспрессии именно этого гена. Большая часть необластов перестает работать (то есть smedwi-1 перестает экспрессироваться ) после облучения дозой 500 рад, при обработке дозой 6000 рад умирают все необласты. Ученые использовали дозу 1750 рад, чтобы оставить минимальную, но не нулевую вероятность необластического восстановления. Как показали эксперименты, некоторое число необластов действительно выживали после облучения такой дозой и начинали делиться. Они были расположены на брюшной стороне животного. На 4-й день после облучения у 22% животных появляются следы работы одного-двух необластов, а через неделю уже можно видеть целые кластеры необластов. Около 16% животных имеют один кластер, а 4% — по два кластера. С течением времени число клеток в кластере увеличивалось экспоненциально (неограниченный рост), и на 20-й день планария уже была полностью обеспечена этими живительными клетками — их была уже тысяча. Число самих кластеров при этом не увеличивается. Следовательно все необласты были потомками клеток — родоначальниц кластеров, а не других выживших клеток тела.

Кластеры необластов на седьмой день после облучения. Маркированы синим продукты экспрессии smedwi-1. Фото из обсуждаемой статьи Clonogenic Neoblasts Are Pluripotent Adult Stem Cells That Underlie Planarian Regeneration в Science

Ученые проследили и дальнейшую судьбу колоний необластов. Они в результате дали предшественников различных типов клеток, в частности нейронов и клеток кишечника. Это было доказано демонстрацией экспрессии генов, специфических для этих типов клеток. Это означает, что необласты способны специализироваться в любом направлении — и в клетки кишечника, и в нервные клетки. Трех необластов, например, всегда достаточно, чтобы восстановить головной отдел червя, восстанавливаются даже глаза-фоторецепторы на головном конце.

Был проделан также исключительно изящный эксперимент по оживлению облученного червя с помощью трансплантации в отмирающую ткань одного единственного необласта. Планарию облучили смертельной дозой в 6000 рад, после чего погибли все необласты и началась дегенерация тканей. Дегенерация тканей у планарий происходит от головного конца к хвостовому, именно это и наблюдали исследователи в эксперименте после облучения. Через 6 недель после облучения погибают все без исключения планарии. Но если облученному червю пересадить один (один!) необласт, то и через 7 недель он не погибнет. И более того, ткани у него начнут регенерацию. Через 8 недель регенерация закончится: планария выжила, сформировались глотка, глаза... Какие клетки послужили источником обновления? Это можно проверить: исследователи протестировали некоторые гены донора трансплантированного необласта и аналогичные гены у счастливо спасенной планарии. Эти гены оказались одинаковыми. Это означает, что единственный пересаженный необласт дал начало всем клеткам выжившего червя. Ученые получили живой клон. Этот клон мог размножаться бесполым путем. Таким образом, эксперимент по трансплантации служит превосходным доказательством плюрипотентности необластов.

После облучения дозой в 6000 рад начинается дегенерация тканей, и червь со всей неизбежностью умирает: звездочками показаны места с отмершей тканью. Однако, если ему пересадить один необласт, то начнется регенерация отмерших тканей, ткани восстанавливаются и червь оживает после своей «клинической» смерти: стрелки показывают места с регенерирующей тканью и новые глаза у ожившего червя. Фото из обсуждаемой статьи «Clonogenic Neoblasts Are Pluripotent Adult Stem Cells That Underlie Planarian Regeneration» в Science

Упрощенная схема работы wnt1-каскада при регенерации головы и хвоста; одна из главных ролей отдана гену notum: он останавливает работу wnt1. Схема из обсуждаемой статьи Polarized notum Activation at Wounds Inhibits Wnt Function to Promote Planarian Head Regeneration в Science

Теперь, положим, червь имеет здоровые необласты, может легко восстановить утраченные части тела (или даже полностью обновить мертвые ткани), но как клетки узнают, в каком направлении им специализироваться? Естественно, существует множество механизмов, действующих здесь и сейчас, обусловленных непосредственным биохимическим окружением формирующейся клетки. Но это лишь общий принцип, конкретика остается чаще всего неизвестной. Для планарии удалось показать, как клетки узнают, где передний, а где задний отдел. Иными словами, ученые выяснили, какие биохимические команды указывают клеткам, специализироваться им в передний или в задний отдел тела, отращивать голову или хвост. В процессе регенерации тканей включается совершенно определенный генно-регуляторный каскад, запускаемый экспрессией гена wnt1. Он через посредничество специфических поверхностных белков регулирует количество бета-катенина, контролирующего экспрессию ядерных генов. Экспрессия wnt1 отслежена по краям разрезов, будь они в переднем или заднем конце животного, обращены вперед или назад.

Однако ген notum экспрессируется только с того края надреза (раны), который направлен вперед, к головному концу. Аналог гена notum известен у дрозофилы; у мух он играет важную роль в эмбриональном развитии, подавляя экспрессию wnt, у млекопитающих этот ген работает, контролируя процесс роста. У планарии, как выяснилось, notum также разрушает поверхностные белки, с которыми связывается wnt1, и таким способом ингибирует его работу. В результате там, где экспрессируется notum, формируется голова с глазами-фоторецепторами, а там, где он не экспрессируется, вырастает хвост. Так что notum каким-то образом — напрямую или косвенно — связан с определением передне-задней полярности тела.

Планарии, регенерировавшие в условиях обработки разными ингибиторами: слева — схема планарии с местом ампутации переднего конца; на левой фотографии — ингибирование wnt1: планария отрастила вторую голову с двумя фоторецепторами; в центре — ингибирование notum: планария отрастила второй хвост; на правой фотографии — ингибирование бета-катенина и notum: животное отрастило вторую голову. Фото из обсуждаемой статьи Polarized notum Activation at Wounds Inhibits Wnt Function to Promote Planarian Head Regeneration в Science

Вот превосходные эксперименты, в которых ученые манипулировали работой notum. В данном случае использовалось ингибирование при помощи РНК-интерференции. Если подавить экспрессию wnt1, то у животного не вырастет хвост, а вместо этого появится лишняя голова (левая фотография). Если подавить экспрессию notum, то примерно у половины животных вместо головы вырастет хвост (средняя фотография), а у второй половины отрастет дефектная голова с одним фоторецептором вместо двух, и в этом дефектном переднем отделе появятся характерные для хвостового отдела биохимические маркеры и морфологические черты. Участие в рабочей схеме бета-катенина подтверждается двойным ингибированием бета-катенина и notum. В этом случае регенерация идет так, как если бы ингибировали только бета-катенин: отрастает голова с фоторецепторами (самая правая фотография).

Нужно отметить, что определение передне-задней полярности тела даже у таких простых животных, как планарии, осуществляется гораздо более сложной и запутанной системой каскадных регуляций, чем обратная связь через notum. Так, вырастить планарию с двумя головами или двумя хвостами можно с помощью ингибирования и другого гена — Smed-prep. Так что и этот ген вместе со всем своим каскадом подключен к совместному решению, где хвост, а где голова.

Работа гена Smed-prep подавлялась с помощью РНК-интерференции. В результате после ампутации переднего отдела у планарии отрастал дефектный передний отдел с одним глазом (A) или второй хвост (В). Фото из статьи Daniel A. Felix, A. Aziz Aboobaker, 2010

Биохимическая схема определения передне-задней полярности тела животных, по всей видимости, достаточно единообразна для многоклеточных животных. Ученые продемонстрировали ее работу у плоского червя, подчеркнув высокое сходство с мухами и млекопитающими. Но биохимические механизмы регенерации, так же как и цитологические механизмы, гораздо эффективнее изучать на плоских червях, чем на млекопитающих. Поэтому у белой планарии, по-видимому, большое научное будущее: она станет превосходным модельным объектом для исследования базовых принципов восстановления клеток и тканей у многоклеточных.

Источники:
1) Daniel E. Wagner, Irving E. Wang, Peter W. Reddien. Clonogenic Neoblasts Are Pluripotent Adult Stem Cells That Underlie Planarian Regeneration // Science. 2011. V. 332. P. 811–816. Doi: 10.1126/science.1203983.
2) Christian P. Petersen, Peter W. Reddien. Polarized notum Activation at Wounds Inhibits Wnt Function to Promote Planarian Head Regeneration // Science. 2011. V. 332. P. 852–855. Doi: 10.1126/science.1202143.