Поиск по сайту
Проект публикации книги «Познай самого себя»
Узнать, насколько это интересно. Принять участие.

Короткий адрес страницы: fornit.ru/6420

Этот материал взят из источника: http://gen.lib.rus.ec/
Список основных тематических статей >>
Этот документ использован в разделе: "Cборник статей по исследованиям психических явлений"Распечатать
Добавить в личную закладку.

От нейрона к мозгу, Николлс Джон, Мартин Роберт, Валлас Брюс, Фукс Пол

Дж

БИБЛИОГРАФИЯ = Николлс Д., Мартин Р., Валлас Б., Фукс П. От нейрона к мозгу / Пер. с англ. П. М. Балабана, А.В.Галкина, Р. А. Гиниатуллина, Р.Н.Хазипова, Л.С.Хируга. — М.: Едиториал УРСС, 2003. — 672 с.

 


 

Николлс Дж., Мартин Р., Валлас Б., Фукс П. От нейрона к мозгу / Пер. с англ. П. М. Балабана, А.В.Галкина, Р. А. Гиниатуллина, Р.Н.Хазипова, Л.С.Хируга. — М.: Едиториал УРСС, 2003. — 672 с.

ЭЛЕКТРОННОЕ ОГЛАВЛЕНИЕ ОБЩЕЕ

ЭЛЕКТРОННОЕ ОГЛАВЛЕНИЕ ДЕТАЛЬНО

 

ПРИМЕЧАНИЕ[Ю1] 

Дж. Г. Николлс, А. Р. Мартин, Б. Дж. Валлас, П. А. Фукс

ОТ НЕЙРОНА

К МОЗГУ


2

FROM

neuron

TO

brain

FOURTH   EDITION

John C. Nicholls

International School for Advanced Studies, Trieste, Italy

A. Robert Martin

Emeritus, University of Colorado School of Medicine

Bruce C. Wallace

University of Colorado School of Medicine

Paul A. Fuchs

The Johns Hopkins University School of Medicine

Sinauer Associates, Inc. · Publishers

Sunderland, Massachusetts · USA


 

Дж. Г. Николлс, А. Р. Мартин, Б. Дж. Валлас, П. А. Фукс

ОТ НЕЙРОНА

К  МОЗГУ

Перевод с четвертого английского издания

под редакцией

П. М. БАЛАБАНА и Р. А. ГИНИАТУЛЛИНА

Москва · 2003


ББК 28.70

Настоящее издание осуществлено при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проект № 02-04-62007)

Николлс Джон, Мартин Роберт, Валлас Брюс, Фукс Пол

От нейрона к мозгу / Пер. с англ. П. М. Балабана, А.В.Галкина, Р. А. Гиниатуллина, Р.Н.Хазипова, Л.С.Хируга. — М.: Едиториал УРСС, 2003. — 672 с., цв. вкл.

ISBN 5-354-00162-5

Цель нового издания знаменитой и ставшей классической в нейробиологии книги «От нейрона к мозгу» осталась той же, что и в первом издании, написанном 25 лет назад. В предисловии к этой книге цель декларирована как: «описать способы передачи сигналов нервными клетками, как сигналы анализируются и как на основе этой интеграции возникают высшие функции мозга. Книга предназначена читателю без специального образования, который интересуется принципами работы нервной системы». В новом издании четыре широко известных нейробиолога в том же ясном стиле описывают существующие факты, методические подходы и концепции, делая упор на экспериментальные данные, как классические, так и самые современные. Фактически более чем на три четверти это совершенно новая книга, так как бурный рост науки о мозге привел к удивительным открытиям в последние десятилетия. Книга снабжена огромным количеством иллюстраций, просто и четко излагаются не только каждая проблема, но и откуда она появилась, как связана с другими вопросами нейробиологии. Очень приятной особенностью книги является то, что авторы не опускают спорные вопросы, четко описывают альтернативные точки зрения и не стесняются сказать, что многие основные проблемы в настоящее время не решены.

Первое издание книги было переведено и стало настольным справочником по основным вопросам физиологии мозга для нескольких поколений русскоязычных исследователей. Первое издание входит как рекомендованная литература практически во все курсы, касающиеся работы мозга, для студентов медицинских и биологических вузов России. Надеемся, что новое полностью переработанное современное издание займет такое же место.

Издательство «Едиториал УРСС». 117312, г. Москва, пр-т 60-летия Октября, 9. Лицензия ИД №05175 от 25.06.2001 г. Подписано к печати 12.05.2003 г. Формат 70x100/16. Тираж 3000 экз. Печ. л. 42. Зак. №  327 Отпечатано в типографии ИПО «Профиздат». 109044, г.Москва, Крутиикий вал, 18.

ISBN 5-354-00162-5

© Sinauer Associates, Inc., 2001 © Едиториал УРСС, 2003


Оглавление

Предисловие редакторов

русского перевода.................   13

Предисловие авторов

к русскому изданию...............    14

Раздел I

Введение                                               13

Глава   1. Принципы передачи

информации и структурная организация мозга..........   15

Взаимосвязи в простых нерпных системах (15). Сложные нейронные сети и высшие функции мозга (15).

§ 1. Строение сетчатки................     17

Образы и связи нейронов (17). Тело клетки, дендриты аксоны (18). Методы идентификации нейронов и прослеживание их связей (18). Ненервные элементы мозга (19). Группировка клеток в соответствии с функцией (20). Подтипы клеток и функция (20). Конвергенция и дивергенция связей (20).

§ 2. Сигналы нервных клеток...........    20

Классы электрических сигналов (21) Универсальность электрических сигналов (21). Техника записи сигналов от нейронов с помо шью электродов (22). Неинвазивные методы регистрации нейронной активности (23). Распределение локальных градуальных потенциалов и пассивные электрические свойства нейронов (23). Распространение изменений потенциала в биполярных клетках и фоторецепторах (24). Свойства потенциалов действия (24). Распространение ПД вдоль нервных волокон (25). ПД как нейронный кол (26). Синапсы: области межклеточной коммуникации (26). Химически опосредованная синаптическая передача (26). Возбуждение и торможение (27). Электрическая передача (28). Модуляция синаптической эффективности (29). Интегративные механизмы (29). Сложность информации, передаваемой потенциалами действия (30).

§ 3. Клеточная и молекулярная

биология нейронов...............    31

§4. Регуляция развития нервной системы   . .    32

§5. Регенерация нервной системы

после травмы...................    33

Выводы.......................    33

Цитированная литература...........    33

Раздел II

Передача информации

в нервной системе                                      34

Глава  2. Ионные каналы

и нейрональная сигнализация . .   34

§ I. Свойства ионных каналов..........    35

Клеточная мембрана нервной клетки (35). Как выглядят ионные каналы? (36). Избирательность каналов (36). Открытое и закрытое состояния (36). Способы активации (37).

§ 2. Измерение токов одиночного канала ... 38 Пэтч-кламп метод (38). Конфигурации пэтч--кламп метода (40). Внутриклеточная микроэлектродная регистрация (41). Внутриклеточная регистрация шума ионных каналов (41). Проводимость каналов (42). Проводимость и проницаемость (44). Равновесный потенциал (44). Уравнение Нернста (45). Движущая сила (46). Нелинейные отношения «ток--напряжение» (46). Проницаемость ионных каналов (46). Значение ионных каналов (47).

Выводы.......................    47

Рекомендуемая литература..........    48

Цитированная литература...........    48

Глава  3. Структура ионных каналов ....   49

§ 1. Никотиновый ацетилхолиновый

рецептор......................    50

Физические свойства АХР рецептора (50). Аминокислотная последовательностьсубъеди ниц АХР (51). Вторичная и третичная структура АХР (51). Структура и функция канала (53). Эмбриональный и взрослый типы АХР в мышце млекопитающих (54). Какие субъединицы АХР выстраивают пору? (54). Структура АХР с высоким разрешением (55). Открытое и закрытое состояния АХР (56). Разнообразие субъеди ниц нейронпльного АХР (56). Субъелиннчная композиция нейрональных АХР (56).

§ 2. Суперсемейства рецепторов.........    57

ГАМ К. глициновые и 5-НТ рецепторы (57). Ионная избирательность лиганд-активируемых ионных каналов (58).

§3. Потенциал-активируемые каналы.....    58

Потенииал-активируемые натриевые каналы (58). Аминокислотная последовательность и третичная структура натриевого канала (60). Потенинал-активируемые кальциевые каналы (60). Потенциал активируемые калиевые каналы (60). Сколько субъединиц в калиевом канале? (61). Строение поры потенциал-активируемых каналов (62). Анализ структуры калиевого канала с высоким разрешением (62).

§4. Другие каналы..................    64


6                                                                    Оглавление

Потенциал активируемые хлорные каналы (64). Калиевые каналы внутреннего выпрямления (64). АТФ активируемые каналы (64). Глутаматные рецепторы (65). Каналы, активируемые циклическими иуклеотидами (66).

§5. Разнообразие субъединиц...........    66

Заключение....................    67

Выводы.......................    67

Рекомендуемая литература..........    68

Цитированная литература...........    68

Глава  4. Транспорт через мембрану

клетки.................   70

§1. Натрий-калиевый обменный насос  ....     71 Биохимические   свойства    натрий-калиевой АТФазы (71). Экспериментальные доказательства электрогенности насоса (72)   Механизм переноса ионов (72).

§ 2. Кальциевые насосы...............    74

АТФазы эндоплазматического и саркоплазма тического ретикулумов (75). АТФазы плазматической мембраны (76).

§ 3. Натрий-кальциевый обменник.......    76

Транспортные системы натрий-кальциевого обмена (76). Реверсия направления работы NCX (77). Натрий-кальциевый обменник в палочках сетчатки (78).

§ 4. Хлорный транспорт...............    78

Хлор-бикарбонатный обменник (79). Калий--хлорный ко-транспорт (79). Транспорт хлора внутрь клетки (79)

§5. Транспорт нейромедиаторов.........    80

Транспорт в синаптичсские пузырьки (80). Механизм закачки медиатора в клетку (81).

§ 6. Молекулярная структура переносчиков   .    82 АТФазы (82). Натрий-кальциевые обменники (82). Переносчики других ионов (82). Молекулы переносчиков иейромелиаторов (82).

§ 7. Роль механизмов транспорта.........    84

Выводы.......................    84

Рекомендуемая литература..........    85

Цитированная литература...........    86

Глава 5. Ионные механизмы

потенциала покоя..........   88

§ 1. Идеальная клетка................    88

Ионное равновесие (89). Электрическая нейтральность (90). Влияние внеклеточного калия и хлора на мембранный потенциал (90).

§ 2. Мембранный потенциал

в аксоне кальмара................    92

Роль натриевой проницаемости (94). Уравнение постоянного поля (94). Потенциал покоя (96). Распределение хлора (97). Электрическая модель мембраны (97). Ожидаемые значения мембранного потенциала (97). Вклад натрий-калиевого насоса в мембранный потенциал (98). Ионные каналы, участвующие в формировании потенциала покоя (98).

§ 3. Изменения мембранного потенциала ...    99 Выводы.......................100

Рекомендуемая литература..........100

Цитированная литература...........   101

Глава  6. Ионные механизмы

потенциала действия........102

§ 1. Натриевые и калиевые токи.........   102

Какое количество ионов входит в клетку и выхолит из нее во время потенциала действия? (103). Положительная и отрицательная обратная связь во время изменений проводимости (104). Измерения проводимости (104). §2. Эксперименте фиксацией потенциала . . 105 Емкость и ток утечки (105). Токи ионов натрия и калия (105). Избирательные яды для натриевых и калиевых каналов (105). Зависимость ионных токов от мембранного потенциала (108). Инактивация натриевого тока (108). Натриевая и калиевая проводимость как функция потенциала (109). Количественное описание натриевой и калиевой проводимостей (ПО). Реконструкция потенциала действия (III). Порог и рефрактерный период (III). Токи воротного механизма (ИЗ). Активация и инактивация одиночных каналов (114). § 3. Молекулярные механизмы активации

и инактивации..................   115

Воротные механизмы потенциалзависимых каналов (115). Инактивация натриевого канала (117). Инактивация калиевого канала типа А (117). Кинетические модели активации и инактивации каналов (118). Свойства канала, связанные с потенциалом действия (119). Вклад открытых калиевых каналов в реполяризацию (120).

§4. Роль кальция в возбуждении клетки   ...   120 Кальциевые потенциалы действия (120). Ионы кальция и возбудимость (120).

Выводы.......................   122

Рекомендуемая литература..........122

Цитированная литература...........123

Глава 7. Нейроны как проводники

электричества  ............ 125

§ 1. Пассивные электрические свойства

нервных и мышечных мембран.......125

Кабельные свойства нервных и мышечных волокон (126). Ток в кабеле (126). Входное сопротивление и постоянная длины (127). Сопротивление мембраны и продольное сопротивление (127). Расчет сопротивления мембраны и внутреннего сопротивления (128). Удельное сопротивление (128). Влияние диаметра кабеля на его характеристики (129). Емкость мембраны (130). Постоянная времени (130). Емкость в кабеле (132).

§2. Распространение потенциала действия ..   133 Скорость проведения (134). Миелинизирован ные нервы и сальтаторная проводимость (134). Скорость проведения в миелинизированных волокнах (135). Распределение каналов в миелинизированных волокнах (136). Каналы в демиелинизированных аксонах (136). Геометрическое строение и блок проводимости (136).

§3. Проведение в дендритах............   138


Оглавление                                                                           7

§4. Токи, протекающие между клетками  . . .   140 Структуры,  обеспечивающие  электрическое сопряжение: щелевые соединения (140).

Выводы.......................   140

Рекомендуемая литература..........   141

Цитированная литература...........   141

Глава  8. Свойства н функции

нейроглиальных клеток......143

Исторический ракурс (143).  Морфология и классификация глиальных клеток (144). Структурные связи между нейронам» и глией (145).

§ 1. Физиологические свойства клеточных

мембран глиальных клеток..........146

Ионные каналы, транспортеры и рецепторы в мембранах глиальных клеток (148). Электрические контакты между глиальными клетками (149).

§ 2. Функции глиальных клеток.........149

Миелин и роль глиальных клеток в проведении возбуждения по аксонам (ISO). Глиальные клетки, развитие UHC и секреция факторов роста (152). Рольмикроглиальных клеток в репарации и регенерации в ЦНС (153). Шванновские клетки как пути роста в периферических нервах (154). Замечание (154).

§ 3. Эффекты нейрональной активности

на глиальные клетки..............   156

Накопление калия во внеклеточном пространстве (156). Прохождение токов и движение калия через глиальные клетки (156). Глия как буфер экстраклеточной концентрации калия (156). Эффекты медиаторов на глиальные клетки (157). Освобождение медиаторов глиальными клетками (158). Кальциевые волны в глиальных клетках (158). Перенос метаболитов от глиальных клеток к нейронам (159). Эффекты глиальных клеток на нейрональную сигнализацию (160).

§4. Глиальные клетки

и гематоэнцефалический барьер......   160

Предположение о роли астроцитов в кровоснабжении мозга (161).

§5. Глиальные клетки

и иммунные ответы в ЦНС   .........   162

Выводы.......................   162

Рекомендуемая литература..........   162

Цитированная литература...........   163

Глава  9. Основы прямой

синаптической передачи......165

§1. Нервные клетки

и синаптические контакты..........166

Химическая передача в вегетативной нервной системе (166). Химическая синаптическая передача в нервно-мышечном соединении позвоночных (167).

§2. Электрическая синаптическая передача .   168 Идентификация и характеристики электрических синапсов (168). Синаптическая задержка в химических и электрических синапсах (169).

§3. Химическая синаптическая передача ...   170

Структура синапса (172). Синаптические потенциалы в нервно-мышечном соединении (172). Определение участков мышечного волокна, чувствительных к АХ ( 173). Другие способы для определения распределения рецепторов АХ (175). Измерение ионных токов, вызванных АХ (176). Почему важно знать потенциал реверсии? (178). Сравнительный вклад натрия, калия и кальция в потенциал концевой ллвстинки (179). Проводимость мембраны в покое и амплитуда синаптического потенциала (179). Кинетика токов через одиночные каналы, активируемые АХ (179). §4. Прямое синаптическое торможение .... 181 Потенциал реверсии тормозных потенциалов (181). Пресинаптическое торможение (183). Десенситизация (185). Рецепторы, которые опосредуют прямую и непрямую химическую передачу (186).

Выводы.......................   186

Рекомендуемая литература..........   187

Цитированная литература...........   187

Глава 10. Механизмы непрямой

синаптической передачи......190

§ 1. Метаботропные рецепторы и G-белки . .   191 Структура метаботропных рецепторов (191). Структура и функция G-белков (192). Десенситизация (193).

§ 2. Прямая модуляция активности ионных

каналов G-белками...............   194

Активация калиевых каналов G белками (194). Ингибирование кальциевых каналов, опосредованное G-белками (195).

§ 3. Активация G-белками внутриклеточных

вторичных посредников............   196

-Адренорецепторы активируют кальциевые каналы через G белки и аденилатциклазу (196). Регуляция активности кальциевых каналов через другие сигнальные пути (198). Модуляция активности кальциевых каналов посредством фосфорилирования (199). Активация фосфолипазы С (201). Активация фосфолипазы аз (202). Сигнализация через NO и СО (203). Модуляция калиевых и кальциевых каналов метаботропными рецепторами (204).

§ 4. Кальций в роли внутриклеточного

вторичного посредника............204

Быстрое ингибирование синаптической передачи, опосредованное кальцием (205). Многообразие путей кальциевой сигнализации (205).

§5. Длительное действие медиаторов

непрямого действия...............205

Выводы.......................207

Рекомендуемая литература..........209

Цитированная литература...........209

Глава 11.  Высвобождение медиатора .... 211

§ 1. Основные свойства процесса

высвобождения медиатора..........212


8                                                                               Оглавление

Деполяризация нервных окончаний и высвобождение медиатора (212). Синаптическая задержка (213). Значение кальция для процесса высвобождения (213). Измерение входа кальция в пресинаптическое нервное окончание (214). Локализация мест входа кальция (216). Роль деполяризации в высвобождении медиатора (217).

§2. Квантовое высвобождение медиатора ... 218 Спонтанное высвобождение квантов медиатора (219). Неквантовое высвобождение (220). Флуктуации потенциала концевой пластинки (220). Статистический анализ потенциалов концевой пластинки (220). Квантовый состав в синапсах между нейронами (224). Количество молекул в кванте (224). Количество каналов, активируемых квантом (225). Изменение размера кванта в нервно-мышечном соединении (227).

§3   Везикулярная гипотеза высвобождения

медиатора.....................227

Ультраструктура нервного окончания (228). Экзоцитоз синаптическич везикул (230). Морфологическое свидетельство в пользу экзоцитоза (230). Круговорот синаптических везикул (233). Наблюдения за экзоцитозом и эндоцитозом в живых клетках (235).

Выводы.......................240

Рекомендуемая литература..........240

Цитированная литература...........241

Глава 12. Синаптнческая пластичность   . . 243

§ 1. Кратковременные изменения........244

Фасилитация и депрессия выброса медиатора (245). Роль кальция в фасилитаиии (246). Усиление синоптической передачи (246). Посттетаническая потенциаиия  (246).

§2. Долговременные изменения.........248

Долговременная потенциаиия (248). Ассоциативная ДВП в пирамидных клетках гиппокампа (249). Механизмы индукции ДВП (250). Механизм проявления ДВП (251). Молчащие синапсы (251). Регуляция количества синаптических рецепторов (252). Пресинаптическая ДВП (253). Долговременная депрессия (254). ДВД в мозжечке (255). Индукция ДВД (256). Системы вторичных посредников, опосредующие ДВД (256). Проявление ДВД (257). Значение изменений синаптической эффективности (257).

Выводы.......................258

Рекомендуемая литература..........258

Цитированная литература...........259

Глава 13.  Клеточная и молекулярная биохимия синаптической передачи................261

§ 1. Нейромедиаторы.................262

Идентификация медиаторов (262). Нейромедиаторы как посредники (263). Молекулы медиаторов (264).

§ 2. Синтез ненромедиаторов...........264

Синтез аиетилхолина (АХ) (266). Синтез дофамина к  норадреналина (268). Синтез  5 HT(270). Синтез ГАМК (271). Синтез глутамата (272). Кратко- и долговременная регуляция синтеза медиаторов (272). Синтез нейропе лтидов (273). §3. Хранение медиаторов

в синаптических пузырьках   .........275

§4. Аксонный транспорт..............276

Скорость и направленность аксон но го транспорта (276). M икротрубочки и быстрый транспорт (277). Механизм медленного аксонного транспорта (278).

§5. Высвобождение медиаторов

и метаболический круговорот везикул . . 279 Сортировка везикул в нервном окончании (279). Консервативные механизмы транспорта сииаптических пузырьков (280). Синаптотагмин и зависимость высвобождения медиаторов от кальция (282). Бактериальные нейротоксины нацелены на SNARE комплекс (282). Восстановление компонентов мембран синаптических пузырьков путем эндоцитоза (282).

§6. Локализация рецепторов медиаторов . . .  283 Пресинаптические рецепторы (285).

§7. Удаление медиаторов

из синаптической щели............285

Удаление АХ ацетилхолинэстеразой (285). Удаление АТФ путем гидролиза (287). Удаление медиаторов путем захвата (287)

Выводы.......................288

Рекомендуемая литература..........288

Цитированная литература...........289

Глава 14.  Нейромедиаторы в центральной

нервной системе...........292

§ 1. Картирование распределения медиаторов 293 ГАМК и глицин: тормозные медиаторы в ЦНС (295). Рецепторы ГАМК (295). Модуляция функции ГАМКд рецепторов бензодиазепинами и барбитуратами (296). Глутаматные рецепторы в ЦНС (297). Оксид азота как медиатор в ЦНС (298). Ацетилхолин: базальные ядра переднего мозга (298). Холинергические нейроны, когнитивные функции и болезнь Альцгеймера (299). АТФ и аденозин как медиаторы UHC (301).

§2, Пептидные медиаторы в ЦНС........301

Субстанция Ρ (302). Опиоидные пептиды (302).

§3. Регуляция функций центральной

нервной системы биогенными аминами . 303 Норадреналин голубое пятно (locus coeruleus) (303). 5-НТ: ядра шва (raphe nuclei) (304). Гистамин:туберомамиллярное ядро (tuberomammillary nucleus) (305). Дофамин: черная субстанция (substantia nigra) (306). О специфичности лекарственных препаратов, действующих на синапсы (308).

Выводы.......................308

Рекомендуемая литература..........309

Цитированная литература...........310


Оглавление                                                                           9

Раздел III

Интегративные механизмы                    313

Глава 15. Клеточные механизмы интеграции и поведения у пиявок, муравьев и пчел   .... 313

§ I. От нейрона к поведению и обратно ....  314

§2. Интеграция информаши отдельными

нейронами в ЦНС пиявки..........315

Ганглии пиявки: полуавтономные единицы (315). Сенсорные клетки в ганглиях пиявки (317). Моторные клетки (320). Взаимодействие чувствительных и двигательных нейронов (320). Кратковременные изменения сина птической передачи (321). Мембранный потенциал, пресинаптическое ингибирование и освобождение медиатора (323). Повторная активность и блок проведения сигнала (324). Высшие уровни интеграции (325). Сенситизация и S интернейроны (325).

§3. Навигация у пчел и муравьев........329

Как пустынный муравей находит дорогу домой (330). Использование поляризованного света как компаса (331). Восприятие поляризованного света глазом муравья (332). Стратегии по поиску дороги к гнезду (334). Нервные механизмы навигации (334). Поляризованный свет и «скрученные» фоторецепторы пчел (twisted photoreceptors) (335). Использование магнитных полей пчелами в навигации (337).

§4. Зачем нужно изучать нервную систему

беспозвоночных?.................338

Выводы.......................339

Рекомендуемая литература..........339

Цитированная литература...........339

Глава 16. Вегетативная (автономная)

нервная система...........342

§ 1. Непроизвольно управляемые функции . .  343 Симпатическая и парасимпатическая нервные системы (343). Синаптическая передача в симпатических ганглиях (345). М-токи в вегетативных ганглиях (347).

§2. Синаптическая передача

от постганглионарных аксонов.......348

Пурин ргическая передача (349). Сенсорные входы вегетативной нервной системы (350). Энтеральная нервная система (351). Регуляция вегетативных функций в гипоталамусе (353). Нейроны гипоталамуса, высвобождающие гормоны (354). Распределение и численность GnRH-секретирующих клеток (354). Циркадные ритмы (355).

Выводы.......................358

Рекомендуемая литература..........358

Цитированная литература...........359

Глава 17. Трансдукция механических

и химических стимулов......361

§ 1. Кодирование стимулов

механорецепторами...............362

Короткие и длинные рецепторы (362). Кодирование параметров стимула рецепторами растяжения (364). Рецепторы растяжения речного рака (365). M ышечные веретена (366). Реакция на статическое и динамическое мышечное растяжение (367). Механизмы адаптации в механорецепторах (367). Адаптация в тельце Пачини (368).

§ 2. Трансдукция механических стимулов . . . 369 Механочувствительные волосковые клетки уха позвоночных (370). Структура рецепторов волосковых клеток (371). Трансдукция через отклонение волоскового пучка (371). Концевые связи и воротные пружины (371). Каналы трансдукции в волосковых клетках (373). Адаптация волосковых клеток (373).

§ 3. Обоняние......................375

Обонятельные рецепторы (375). Обонятельный ответ (376). Каналы обонятельных рецепторов, управляемые циклическими нуклеотидами (376). Сопряжение рецептора с ионными каналами (376). Специфичность одорантов (378).

§ 4. Механизмы вкуса................378

Вкусовые рецепторные клетки (378). Соленый и кислый вкус (379). Сладкий и горький вкус (380). Молекулярные рецепторы для глутамата и чили (380).

§ 5. Трансдукция ноцицептивных

и температурных стимулов..........381

Активация и сенситизация ноцицепторов (381).

Выводы.......................382

Рекомендуемая литература..........383

Цитированная литература...........383

Глава 18. Обработка соматосенсорных

и слуховых сигналов........386

§ 1. Соматосенсорная система: тактильное

распознавание   ..................387

Организация рецепторов тонкого прикосновения (387). Кодирование стимула (388). Центральные проводящие пути (389). Соматосенсорная кора (390). Свойства ответов корковых нейронов (391). Латеральное торможение (392). Параллельная обработка сенсорных модальностей (393). Вторичная и ассоциативная Соматосенсорная кора (394). Болевые и температурные проводящие пути (395). Центральные пути боли (395).

§ 2. Слуховая система:

кодирование частоты звука..........397

Улитка (398). Частотная избирательность: механическая настройка (398). Эфферентное торможение улитки (400). Электрическая подвижность волосковых клеток улитки млекопитающих (402). Электрическая настройка волосковых клеток (402). Калиевые каналы волосковых клеток и их настройка (404). Слуховые проводящие пути (405). Слуховая кора (406). Локализация звука (409).

Выводы.......................410

Рекомендуемая литература..........411

Цитированная литература...........411


10                                                                           Оглавление

Глава 19. Передача и кодирование

сигнала в сетчатке глаза   .....414

§1. Глаз..........................415

Анатомия проводящих путей зрительного анализатора (4IS). Конвергенция и дивергенция связей (416).

§2. Сетчатка......................416

Слои сетчатки (416). Палочки и колбочки (417). Организация и морфология фоторецепторов (418). Электрические сигналы в ответ на свет в фоторецепторах позвоночных (419).

§3. Зрительные пигменты.............420

Поглощение светв зрительными пигментами (420). Строение родопсина (420). Колбочки и цветовое зрение (421). Цветовая слепота (423).

§4. Передача сигнала в фоторецепторах .... 424 Свойства каналов фоторецептора (425). Молекулярная структура цГМФ-упрааляемых каналов (425). Метаболический каскад циклического ГМФ (426). Рецепторы позвоночных, деполяризующиеся при действии света (426). Усиление сигнала в каскаде цГМФ (427). Сигналы в ответ на одиночные кванты света (427).

§5. Передача сигнала от фоторецепторов

на биполярные клетки.............429

Биполярные, горизонтальные и амакрииовые клетки (429). Медиаторы в сетчатке (430). Концепция рецептивных полей (431). Ответы биполярных клеток (432). Структура рецептивных полей биполярных клеток (433). Горизонтальные клетки и ингибирование периферии (433). Значение структуры рецептивных полей биполярных клеток (435).

§ 6. Рецептивные поля ганглиозных клеток. . 435 Эфферентные сигналы сетчатки (435). Использование дискретных зрительных стимулов для определения рецептивных полей (436). Организация рецептивных полей ганглиозных клеток (436). Размеры рецептивных полей (438). Классификация ганглиозных клеток (438). Синаптические входы на ганглиозные клетки, определяющие организацию рецептивных полей (439). Что за информацию передают ганглиозные клетки? (439).

Выводы.......................440

Рекомендуемая литература..........441

Цитированная литература...........441

Глава 20. Кодирование сигнала

в латеральном коленчатом теле

и первичной зрительной коре   . . 443

§ 1. Латеральное коленчатое тело........444

Карты зрительных полей в латеральном коленчатом теле (446). Функциональные слои ЛКТ(447).

§2. Цитоархитектоника зрительной коры ... 448 Входящие, исходящие пути и послойная организация коры (450). Разделение входящих волокон от ЛКТ в слое 4 (451).

§ 3. Стратегии изучения коры...........452

Рецептивные поля коры (453). Ответы простых клеток (454). Синтез простого рецептивного поля (456). Ответы сложных клеток (457). Синтез сложного рецептивного поля (458). Рецептивные поля: единицы восприятия формы (459).

Выводы.......................463

Рекомендуемая литература..........463

Цитированная литература...........464

Глава 21. Функциональная архитектура

зрительной коры...........465

§1. Колонки с доминированием одного

глаза и ориентационные колонки.....466

Ориентационные колонки (467). Связь между колонками глазного доминирования и ориентационными колонками (469).

§ 2. Параллельная обработка информации

о форме, движении и цвете   .........469

Крупноклеточные, мелкоклеточные и кониоклеточные «каналы» передачи информации (470). Цитохромоксидазныс метки в виде «полос» и «пятен» (470). Проекции в зрительную зону 2 (V2) (470). Ассоциативные зоны зрительной коры (471). Детекция движения и зона МТ (472). Зона МТ и зрительное слежение (472). Цветовое зрение (473). Пути цветного зрения (474). Цветовое постоянство (475).

§ 3. Интеграция зрительной информации . . . 476 Горизонтальные связи в пределах первичной зрительной коры (476). Рецептивные поля обоих глаз, конвергирующие на кортикальных нейронах (477). Связи, объединяющие правое и левое зрительные поля (478).

§ 4. Что дальше?....................480

Регистрация работы клеток (480). Лица и буквы (480).

Выводы.......................482

Рекомендуемая литература..........483

Цитированная литература...........483

Глава 22. Клеточные механизмы

двигательного контроля......486

§ 1. Двигательная единица.............488

Синаптические входы на мотонейрон (488). Одиночные Синаптические потенциалы мотонейронов (489). Принцип размера и градуальное сокращение (491).

§ 2. Спинальные рефлексы.............493

Реципрокная иннервация (493). Сенсорная информация от мышечных рецепторов (494). Эфферентный контроль мышечных веретен (495). Сгибательные рефлексы (496).

§3. Генерация координированных движений    496 Генераторы центрального ритма (497). Локомоция (498). Взаимодействия сенсорной импульсации и центральных генераторов ритма (499). Дыхание (500).

§4. Организация двигательных путей   .....503

Организация спинальных мотонейронов (503). Супраспинальиый контроль мотонейронов


                                                                                Оглавление                                                                         11

(503). Латеральные двигательные пути (503). Медиальные двигательные пути (504).

§5. Двигательная кора и выполнение

произвольных движений   ...........50S

Ассоциативная двигательная кора (506). Активность кортикальных нейронов (507). Активность корковых нейронов, связанная с направлением движения (508). Планирование движения (508).

§6. Мозжечок   .....................509

Мозжечковые связи (510). Клеточное строение коры мозжечка (511). Клеточная активность в ядрах мозжечка (512). Нарушения у па ииентов с повреждениями мозжечка (513).

§7. Базальные ганглии   ...............514

Нейронные сети банальных ганглиев (SI5). Клеточная активность в Вязальных ганглиях (516). Болезни базальных ганглиев (516).

Выводы.......................517

Рекомендуемая литература..........518

Цитированная литература...........519

Раздел IV

Развитие нервной системы                 522

Глава 23. Развитие нервной системы .... 522

Терминология (S23). Генетические подходы к пониманию процесса развития (524).

§ 1. Развитие нервной системы

в раннем периоде................524

Образование предшественников нервных клеток и глии (527). Миграция нейронов в ЦНС (527). Белки адгезии внеклеточного матрикса и миграция клеток нервного гребня (527).

§2. Региональная спецификация

нервной ткани..................528

Гомеотические гены и сегментация (530). Хорда и базальная пластинка (531). Общая схема региональной дифференцировки (531).

§3. Происхождение нейронов и клеток глии 532 Происхождение клеток и индукционные взаимодействия в простых нервных системах (532). Индукционные взаимодействия при разлитии глаз дрозофилы (533). Происхождение клеток в ЦНС млекопитающих (535). Взаимосвязь между временем образования нейронов и судьбой клеток (536). Генетические аномалии строения коры у мышей линии iveler(S3S) Влияние локальных сигналов на корковую архитектуру (539). Гормональный контроль за развитием нервной системы (539). Стволовые нервные клетки (539). Контроль за фенотипом нейронов в ПНС (540). Выбор трансмиттера в ПНС (542).

§4. Рост аксона....................544

Конус роста, удлинение аксона и роль актина (544). Молекулы адгезии клетки и внеклеточного мвтрикса и рост аксона (545).

§5. Управление ростом аксона..........548

Навигация вксона, зависящая и не зависящая от клетки-мишени (548). Навигация по клеткам-ориентирам (guidepost cells) (549). Сина-

птические взаимодействия с клетками-ориентирами (549). Механизмы управления аксоном (549). Навигация конусов роста в спинном мозге (550). Семейство хеморепеллентов семафорины (553). Модуляция ответов на хеморепелленты и хемоаттрактанты (554).

§6. Иннервация клетки-мишени.........554

§ 7. Образование синапсов.............556

Накопление рецепторов к аиетилхолину (556). Вызванная агрином синаптическая дифференцировка (557). Образование синапсов в ЦНС (560).

§8. Факторы роста и выживание нейронов. . 561 Фактор роста нерва (nerve growth factor) (561). Захват и ретроградный транспорт ФРН (561). Факторы роста семейства нейротрофинов (562). Нейротрофины в ЦНС (563). Рецепторы к иейротрофинам (563)

§ 9. Конкурентные взаимодействия

во время развития................564

Гибель нейронов (564). Уменьшение числа связей и исчезновение полинеирональной иннервации (566). Активность нервов и исчезновение синапсов (567). Нейротрофины и уменьшение количества связей (568).  § 10. Общие размышления

о нейронной специфичности........569

Выводы.......................569

Рекомендуемая литература..........570

Цитированная литература...........572

Глава 24. Денервация и регенерация

синаптических связей.......576

§ 1. Изменения в аксотомированных нейронах и окружающих

глиальных клетках................577

Валлеровская дегенерация (577). Ретроградные транссинаптичсские эффекты аксотомии (577). Трофические субстанции и эффекты аксотомии (578).

§ 2. Эффекты денервации

на постсинаптические клетки........579

Депонированная мышечная мембрана (579). Появление новых АХ рецепторов после денервации или длительной инактивации мышцы (580). Синтез и деградация рецепторов в денервированной мышце (581). Роль инактивации мышцы в денерваиионной гиперчувствительности (581). Роль ионов кальция в развитии гиперчувствительности в денервированной мышце (582). Нервные факторы регуляции синтеза АХ рецептора (583). Распределение рецепторов в нервных клетках после денервации (585). Восприимчивость нормальной и денервированной мышцы к новой иннервации (586). Гиперчувствительность и формирование синапса (587). Аксональный рост, индуцированный денервацией (587).

§ 3. Регенерация периферической нервной

системы позвоночных.............587

Восстановление поврежденных аксонов (587). Специфичность реиннервации (589). Свойства иерва и мышцы после образования синапса чужим нервом (591).


12                                                                             Оглавление

g 4. Роль базальной мембраны в регенерации

нервно-мышечных синапсов.........592

Синаптическая базальная мембрана и формирование синаптической специализации (592). Илентификаиия афина (592).

§5. Регенерация в ЦНС млекопитающих . . . 594 Роль глиальных клеток в регенерации ЦНС (595). Мосты из шванновских клеток и регенерация (596). Формирование синапсов при регенерации аксоноа в ЦНС млекопитающих (597). Регенерация в незрелой ЦНС млекопитающих (598) Нейрональные трансплантанты (599).

Выводы.......................601

Рекомендуемая литература..........602

Цитированная литература...........603

Глава 25.  Критические периоды развития

зрительной и слуховой систем . . 606

§ I. Зрительная система у новорожденных

обезьян и котят..................607

Рецептивные поля и свойства кортикальных клеток новорожденных животных (607). Глазодоминантные колонки у новорожденных обезьян и котят (608). Формирование глазодоминантных колонок (610). Развитие строения коры в эмбрионе (611). Генетические факторы в развитии зрительных сетей (611).

§ 2. Последствия аномального сенсорного

опыта в ранние периоды жизни   ......612

Развитие слепоты после закрытия век (612). Ответы кортикальных клеток после монокулярной депринацин (613). Относительная значимость диффузного света и формы объектов для поддержания в норме ответов кортикальных клеток (613). Морфологические изменения в ЛКТ после зрительной деприваиии (613). Морфологические изменения в коре после зрительной деприваиии (614). Критический период чувствительности к закрытию век (614). Восстановление во время критического периода (615).

§ 3. Необходимые условия для поддержания функционирования нервных связей

в зрительной системе..............618

Бинокулярная деприваиия и роль конкуренции (618). Эффекты страбизма (косоглазия) (619). Изменения в ориентационном предпочтении (620). Критические периоды в развитии зрительной системы человека и их клиническое значение (621).

§4. Клеточные и молекулярные механизмы

депривационных изменений.........623

Влияние импульсной активности на строение коры (623). Синхронизованная спонтанная активность при отсутствии стимуляции во время развития (624). Клеточные механиз мы пластичности соединений (625). Роль трофических веществ в поддержании нейронных связей (625). Разделение сигналов без их конкуренции (626).

§ 5. Критические периоды развития

слуховой системы................626

Слуховой и зрительный опыт у новорожденных амбарных сов (627). Результат обогащенного сенсорного опыта, приобретенного в ранний период жизни (630).

§6. Критические периоды для развития

высших функций   ................631

В чем же биологическое знамение критических периодов? (631)

Выводы.......................632

Рекомендуемая литература..........632

Цитированная литература...........633

Раздел V

Выводы                                                           635

Глава 26. Нерешенные вопросы.......635

Клеточные и молекулярные исследования нейроналышх функций (636). Функциональное значение межклеточного перемещения веществ (636). Развитие и регенерация (636). Генетические подходы оценки функций нервной системы (637). Сенсорная и моторная интеграция (637). Ритмичность (638). Вклад клинической неврологии а изучение мозга (638). Вклад фундаментальной нейронауки в неврологию (639). Степень прогресса (640).

Заключение....................640

Рекомендуемая литература..........640

Цитированная литература...........641

Приложение А. Электрический ток

в цепи.............642

Термины и единицы измерения при описании электрического тока (642). Закон Ома и электрическое сопротивление (643). Применение закона Ома при расчетах (цепей) (644). Применение анализа цепи к модели мембраны (645). Электрическая емкость и постоянная времени (645).

Приложение В. Метаболические пути синтеза и инактивации низкомолекулярных медиаторов .......... 649

Приложение С. Структуры

и пути мозга.........656

Словарь терминов.................664

Часто встречаемые сокращения........668

Указатель определений

основных терминов................669


Предисловие редакторов русского перевода

Данная книга является переводом четвертого издания знаменитой и ставшей классической книги «От нейрона к мозгу». Первое издание этой книги, написанной Стефеном Куффлером и Джоном Николлсом в 1975 году, было переведено на русский язык и вышло в СССР в 1979 году под редакцией профессора Л. Г. Магазаника. Несмотря на большой тираж, книга быстро исчезла с прилавков магазинов и стала настольным учебником для нескольких поколений нейрофизиологов. Последующие английские издания книги были существенно переработаны новым коллективом авторов, однако ни второе, ни третье издание в России не выходили. Публикация на русском языке данного, четвертого издания стала возможной благодаря поддержке Российского фонда фундаментальных исследований. Возвращение к этой книге в начале нового тысячелетия кажется нам символичным — новое издание для нового поколения означает, надеемся, возрождение интереса к науке. Цель нового издания, декларированная в предисловии к английскому изданию, осталась той же, что и первого, написанного более четверти века назад — «описать способы передачи сигналов нервными клетками, как сигналы анализируются и как на основе этой интеграции возникают высшие функции мозга». Однако, фактически, это новая книга, написанная в соответствии с бурным развитием нейробиологии последних лет. В предисловии, специально написанном к русскому переводу четвертого издания, Джон Николлс особо выделяет предмет «нейробиология» как междисциплинарную науку, способную интегрировать знания и подходы смежных наук. В России нейробиология пока не выделена в отдельный предмет, как это произошло в большинстве известных западных университетов. Книга «От нейрона к мозгу» может стать для студентов, по сути дела, учебником по нейробиологии. Мы намеренно представили часть текста в подписях к рисункам как на русском, так и на оригинальном английском языке. Нам кажется, что это позволит студентам и начинающим ученым легче освоить специфическую терминологию и быстрее интегрироваться в интернациональное научное сообщество.

Новая книга сохранила узнаваемые черты первого издания, такие как доступность и простота толкования самых сложных явлений в сочетании с высокой научностью, логично отслеженная взаимосвязь различных вопросов нейробиологии, огромное количество ярких наглядных иллюстраций. Объяснение каждого процесса ведется логично и последовательно, мысль авторов четка и ясна. Приятной особенностью книги является то, что авторы не опускают спорные вопросы, описывают альтернативные точки зрения и указывают на нерешенные в настоящее время проблемы. Последнее особенно ценно, поскольку это указания экспертов в этой области на перспективные направления возможного дальнейшего развития нейронауки. Не оставлен без внимания и исторический анализ развития представлений о работе мозга, что делает книгу эмоциональной и увлекательной.

Постоянным автором и главным инициатором всех четырех изданий является Джон Николлс (John Nicolls), профессор Международной высшей школы (SISSA) в Триесте (Италия). Другими авторами являются известные нейробиологи Брюс Валлас (Bruce G.Wallace) и Роберт Мартин (A. Robert Martin) (University of Colorado), а также Пол Фукс (Paul A. Fuchs) (The John Hopkins University). Все авторы внесли существенный личный вклад в разработку излагаемых проблем, что обеспечило «взгляд изнутри» на многие проблемы нейробиологии и привнесло в изложение особую достоверность и точность.

Первое издание «От нейрона к мозгу» до сих пор входит как рекомендованная литература практически во все курсы, касающиеся работы мозга, для студентов медицинских и биологических вузов России. Надеемся, что новое, полностью переработанное современное издание займет такое же место.

П. Балабан Р. Гиниатуллин


Предисловие авторов к русскому изданию

При написании «От нейрона к мозгу» я и мои коллеги прежде всего преследовали цель создания легко читаемой книги, которая помогла бы студентам медицинских и биологических факультетов в освоении знаний о нервной системе. Мы надеялись, что книга будет полезна и исследователям в этой области, равно как и физикам, инженерам и молекулярным биологам.

Термины «нейробиология» и «нейронауки» вошли в обиход в 60-е годы XX в., когда Стивен Куффлер создал в медицинской школе Гарвардского университета первый факультет, сотрудниками которого стали физиологи, анатомы и биохимики. Работая вместе, они решали проблемы функционирования и развития нервной системы, исследовали молекулярные механизмы работы мозга. До этого ученые этих специальностей работали отдельно, и учебники того времени отражают существовавшее разделение. Настоящая книга представляет собой особый подход к экспериментальному анализу и отражает развитие ключевых концепций науки о мозге вне зависимости от используемых методов.

Авторы книги очень надеялись на то, что богато иллюстрированный материал будет легко доступен каждому студенту, который просто пролистает книгу и решит, стоит ли ее прочесть. Несмотря на то, что английский язык сейчас стал необходимой частью образования исследователя, текст не на родном языке всегда воспринимается труднее. Теряется та часть научного подхода, которую мы старались передать в книге: красота науки, элегантность экспериментов, связь между классическими исследованиями прошлых лет и открывающиеся сегодня горизонты будущего. Именно поэтому известие о том, что вскоре появится русский перевод последнего издания нашей книги, так радует авторов. Стивен Куффлер всегда надеялся, что его книга будет переведена на другие языки. Первое издание книги было блестяще переведено в 1979 году нашим другом профессором Львом Магазаником из Института эволюционной физиологии и биохимии АН СССР (Ленинград). С тех пор было сделано столько ключевых открытий и настолько изменилось наше понимание механизмов работы мозга, что появление на русском языке книги для студентов о современной нейронауке стало необходимостью.

Многие известные ученые России и бывшего СССР внесли огромный вклад в наше понимание биофизических, нейрохимических и высших функций мозга, что послужило основой для развития исследований синаптической передачи, передачи зрительного сигнала, механизмов моторного контроля, функций коры мозга и механизмов обучения. Этот вклад и создание признанных научных школ также лежат в основе появившегося в последнее время в мире нового интереса к нейронаукам.

Как всегда, авторы благодарят нашего издателя Э. Синауэра за помощь в издании оригинала и русского перевода. Мы благодарим наших друзей профессоров П. Балабана и Р. Гиниатуллина за их усилия по редактированию и выпуску российского издания. Переводчики Л. Хируг, Р. Хасипов и А. Галкин, вместе с редакторами быстро и профессионально завершили подготовку издания. Несомненным достоинством книги является сохранение оригинальных подписей на английском языке, что позволяет легче перейти к анализу мировой литературы.

Мы надеемся, что настоящее издание послужит дальнейшим стимулом к развитию интереса к бурно развивающимся в настоящее время нейронаукам, вклад в которые российских ученых неоспорим.

Джон Николлс 2003 г., Триест, Италия


Раздел I. ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. Принципы передачи информации и структурная организация мозга

Центральная нервная система представляет собой непрерывно работающий конгломерат клеток, которые постоянно получают информацию, анализируют ее, перерабатывают и принимают решения. Мозг способен также брать инициативу на себя и производить координированные, эффективные мышечные сокращения для ходьбы, глотания или пения. Для регуляции многих аспектов поведения и для прямого или непрямого контроля всего тела, нервная система обладает огромным количеством линий коммуникаций, обеспечиваемых нервными клетками (нейронами). Нейроны представляют собой основную единицу, или составной блок, мозга. Наша задача — изучить значение их взаимодействия.

Одна из целей этой книги приведена в названии. В последующих главах мы попытаемся объяснить поведение и сложные функции мозга в терминах активности нервных клеток. Второй целью является рассмотрение клеточных и молекулярных механизмов межнейронного взаимодействия. Третья цель связана с изучением способов образования структур и связей, которые лежат в основе функций развивающегося организма, как эти функции и связи изменяются с опытом и могут восстановиться после повреждения. В настоящей главе мы суммируем ключевые концепции и основы рассматриваемых явлений.

Взаимосвязи в простых нервных системах

События, которые происходят при реализации простых рефлексов, могут быть прослежены и проанализированы детально. Например, когда по коленной связке ударяют маленьким молоточком, мышцы и сухожилия бедра растягиваются и электрические импульсы по сенсорным нервным волокнам идут в спинной мозг, в котором возбуждаются моторные клетки, производя импульсы и активируя мышечные сокращения. Конечным результатом является распрямление ноги в коленном суставе. Такие упрощенные схемы очень важны для регулировки мышечных сокращений, управляющих движениями конечностей. В таком простом рефлексе, в котором стимул ведет к определенному выходу, роль сигналов и взаимодействий всего двух видов клеток может быть успешно проанализирована.

Сложные нейронные сети и высшие функции мозга

Анализ взаимодействия нейронов в сложных путях, вовлекающих в буквальном смысле миллионы нейронов, существенно более труден, чем анализ простых рефлексов. Пере-


16                                                       Раздел I. Введение

дача информации в мозг при восприятии звука, прикосновения, запаха или зрительного образа требует последовательного вовлечения нейрона за нейроном, так же как и при выполнении простого произвольного движения. Серьезная проблема при анализе взаимодействия нейронов и структуры сети возникает из-за плотной упаковки нервных клеток, сложности их взаимосвязей и обилия типов клеток. Мозг устроен не так, как печень, которая состоит из одинаковых популяций клеток. Если вы обнаружили, как работает одна область печени, то вы знаете очень много о печени в целом. Знания о мозжечке, однако, ничего не скажут вам о работе сетчатки или любой другой части центральной нервной системы.

Несмотря на огромную сложность нервной системы, сейчас возможно проанализировать много способов взаимодействия нейронов при восприятии. Например, записывая активность нейронов в пути от глаза к мозгу, можно проследить сигналы сначала в клетках, специфически отвечающих на свет, и затем, шаг за шагом, по последовательным переключениям, до высших центров мозга.

Интересной особенностью работы зрительной системы является способность выделять контрастные образы, цвета и движения в огромном диапазоне интенсивностей цвета. Когда вы читаете эту страницу, сигналы внутри глаза обеспечивают возможность для черных букв выделяться на белой странице в слабоосвещенной комнате или при ярком солнечном освещении Специфические связи в мозге образуют единую картину, несмотря на то, что два глаза расположены раздельно и сканируют отличающиеся области внешнего мира. Более того, существуют механизмы, обеспечивающие постоянство образа (хотя наши глаза непрерывно двигаются) и дающие точную информацию о расстоянии до страницы.

Каким образом связи нервных клеток обеспечивают подобные явления? Несмотря на то, что мы еще не способны дать полное объяснение, сейчас многое известно о том, как эти свойства зрения обеспечиваются простыми нейрональными сетями в глазе и на начальных стадиях переключения в мозге. Конечно, остается много вопросов о том, каковы связи между свойствами нейронов и поведением. Так, для того чтобы прочесть страницу, вы должны сохранять определенное

Рис. 1.1. Пути от глаза до мозга через оптический нерв и оптический тракт.

Fig. 1.1. Pathways from the Eyes to the Brain through the optic nerve and the optic tract. The interposed relay is the lateral geniculate nucleus. Arrows indicate how images are reversed by the lens and how the specific crossing of axons causes the right visual field to be represented in the left brain, and vice versa. The figure has been modified from an original by Ramo y CajaL which dates from 1892 (11909-1911] Eng. trans. 1995).

 

положение тела, головы и рук. Далее, мозг должен обеспечить постоянное увлажнение глазного яблока, постоянство дыхания и многие другие непроизвольные и неподконтрольные сознанию функции. Подобные проблемы, предусматривающие описание целостной картины координированных движений тела, выходят за рамки этой книги.

В дальнейшем мы рассмотрим принципы организации нервной клетки, возникновения и распространения электрических сигналов от нейрона к нейрону. Функционирование сетчатки является хорошим примером основных принципов работы нервной системы.


Глава 1. Передача информации и структурная организация мозга                           17

Рис. 1.2. Структура и связи клеток в сетчатке млекопитающих.  (А)  Схема  направления  сигнала  от  рецептора  к  оптическому  нерву по Рамон-и-Кахалю. (В) Распределение по Рамон-и-Кахалю клеточных элементов сетчатки. (С) Рисунки палочки и колбочки сетчатки человека.

Fig. 1.2. Structure and Connections of Cells in the Mammalian Retina. The photoreceptors (rods and cones) connect to bipolar cells. Bipolar cells in turn connect to ganglion cells, whose axons constitute the optic nerve. Horizontal cells (not shown) and amacrine cells make connections that are predominantly horizontal. (A) The scheme proposed by Ramon y Cajal for the direction taken by signals as they pass from receptors to the optic nerve fibers. This scheme still holds in general but essential new pathways and feedback groups have been discovered since Ramon y Cajal's time. (B) Ramon y Cajal's depiction of the cellular elements of the retina and their orderly arrangement. The Mueller cell (M) shown on the right is a satellite glial cell. (C) Drawings of a human rod (left) and cone (right) isolated from the retina. Light passes through the retina (in these drawings from bottom to top) to be absorbed by the outer segment (top) of the photoreceptor. There it produces a signal that spreads to the terminal to influence the next cell in line. By recording electrically from each cell in the retinal circuit we can follow signals step by step and understand how the meaning of the signals changes. (After Ramon y Cajal, 1995.)

§ 1. Строение сетчатки

Анализ зрительного мира зависит от информации, поступающей от сетчатки, где происходит первая стадия обработки, устанавливающая пределы для нашего восприятия. На рис. 1.1 показаны пути от глаза до высших центров мозга. Изображение, попадающее на сетчатку, перевернуто, но во всех других аспектах представляет собой добросовестное представление о внешнем мире. Каким образом эта картинка может быть передана в наш мозг посредством электрических сигналов, которые возникают в сетчатке и затем путешествуют по оптическим нервам?

Образы и связи нейронов

На рис. 1.2 показаны разные типы клеток и их расположение в сетчатке. Свет, попадающий в глаз, проходит сквозь слои прозрачных клеток и достигает фоторецепторов. Сигналы, передаваемые из глаза по волокнам оптического нерва, являются единственными информационными сигналами, на которых основано наше зрение.

Схема прохождения информации по сетчатке (рис. 1.2А) была предложена Сантьяго Рамон-и-Кахалем1) в конце XIX века. Он был одним из величайших исследователей нервной системы и проводил эксперименты на самых разных животных. Он сделал существенное обобщение о том, что форма и расположение нейронов, так же как область возникновения и конечная мишень нейрональных сигналов в сети, дают важнейшую информацию об функционировании нервной системы.

На рис. 1.2 ясно видно, что клетки в сетчатке, как и в других частях центральной нервной системы (ЦНС), очень плотно упакованы. Вначале морфологам приходилось разрывать нервную ткань на части, чтобы увидеть отдельные нервные клетки. Методы, при которых окрашивают все нейроны, практически бесполезны для исследования формы и связи клеток, потому что такие структуры, как сетчатка, выглядят подобно темному пятну переплетенных клеток и отростков. Электронная микрофотография на рис. 1.3 показывает, что экстраклеточное пространство вокруг нейронов и поддерживающих клеток составляет всего 25 нанометров в ширину. Большая часть рисунков Рамон-и-Кахаля была сделана с помощью метода окраски по Гольджи, ко-


18                                                                  Раздел I. Введение

 

Рис. 1.3. Плотная упаковка нейронов в сетчатке обезьяны. Помечена одна палочка (R) и одна колбочка (С).

Fig. 1.3. Dense Packing of Neurons in Monkey (Macaque) Retina. This electron micrograph shows a characteristic feature of the central nervous system: The cell membranes are separated by narrow, fluid-filled clefts. The photoreceptors and their processes can be followed to the outer plexiform layer where their terminals contact bipolar and horizontal cells. One cone (C) and one rod (R) are labeled. (Micrograph kindly provided by P. Sterling and Y. Tsukamoto.)

торый окрашивает с помощью неизвестного механизма всего несколько случайных нейронов из всей популяции, но эти несколько нейронов окрашены полностью.

Схема на рис. 1.2 показывает принцип упорядоченного расположения нейронов в сетчатке. Легко отличить фоторецепторы, биполярные и ганглиозные клетки. Направление передачи идет от входа к выходу, от фоторецепторов к ганглиозным клеткам. Кроме того, два других типа клеток, горизонтальные и амакриновые, образуют связи, соединяющие разные пути. Одной из целей нейробиологии, присутствующей в рисунках Рамон-и-Кахаля, является стремление понять, как каждая клетка участвует в создании картины мира, которую мы наблюдаем.

Тело клетки, дендриты, аксоны

Ганглиозная клетка, показанная на рис. 1.4, иллюстрирует особенности строения нервных клеток, присущие всем нейронам центральной и периферической нервной системы. Клеточное тело содержит ядро и другие внутриклеточные органеллы, общие для всех клеток. Длинный отросток, который покидает тело клетки и образует связь с клеткой--мишенью, называется аксоном. Термины дендрит, тело клетки и аксон применяются к отросткам, на которых входящие волокна образуют контакты, играющие роль принимающих станций для возбуждения или торможения. Кроме ганглиозной клетки, на рис. 1.4 показаны другие виды нейронов. Термины для описания структуры нейрона, в частности дендритов, несколько спорны, но, тем не менее, они удобны и широко применяются.

Не все нейроны соответствуют простому строению клетки, показанному на рис. 1.4. У некоторых нейронов нет аксонов; у других есть аксоны, на которых образуется связь. Есть клетки, чьи дендриты могут проводить импульсы и образовывать связи с клетками--мишенями. Если ганглиозная клетка соответствует схеме стандартного нейрона с дендритами, телом и аксоном, то другие клетки не соответствуют этому стандарту. Например, у фоторецепторов (рис. 1.2С) нет очевидных дендритов. Активность фоторецепторов не вызывается другими нейронами, но активируется внешними стимулами, освещением. Другим исключением в сетчатке является отсутствие, аксонов у фоторецепторов.

Методы идентификации нейронов и прослеживание их связей

Хотя техника Гольджи все еще широко используется, многие новые подходы облегчили функциональную идентификацию нейронов и синаптических связей. Молекулы, которые окрашивают нейрон полностью, могут быть инъецированы через микропипетку, которая одновременно регистрирует электрический сигнал. Флуоресцентные маркеры, такие как люцифер желтый, позволяют увидеть самые тонкие отростки в живой клетке. Внутриклеточно могут быть введены такие маркеры, как фермент пероксидазы хрена (ПХ) или биоцитин; после фиксации они образуют плотный продукт или ярко светятся в флуоресцентном свете. Нейроны можно окрасить пероксидазой хрена и при экстраклеточной аппликации; фермент захватывается и транспортируется в тело клетки. Флуоресцентные карбоциановые красители при соприкосновении с мембраной нейрона растворяются и диффундируют по всей поверхности клетки. Эти приемы


Глава 1. Передача информации и структурная организация мозга                          19

Рис. 1.4. Формы  и  размеры нейронов.

Ид. 1.4. Shapes and Sizes of Neurons. Neurons have branches (the dendrites)  on which other neurons form synapses, and axons that in turn make connections with other neurons. The motor neuron, drawn by Deiters in 1869, was dissected from a mammalian spinal cord. The other cells, stained by the Golgi method, were drawn by Ramon y CajaL The pyramidal cell is from the cortex of a mouse, the mitral cell from the olfactory bulb (a relay station in the pathway concerned with smell) of a rat the Purkinje cell from human cerebellum, and the ganglion cell from mammalian retina (animal not specified). (After Ramon y CajaL 1995.)

 

Рис. 1.5. Группа биполярных клеток, окрашенных антителом на фермент фосфокиназа С. Только содержащие фермент клетки окрасились.

Fig. 1.5. Population of Bipolar Cells Stained by an Antibody against the enzyme phosphokinase C. Only bipolar cells that contain the enzyme are stained. Above are photoreceptors; below are ganglion cells. (Photograph kindly provided by H. M. Young and D. I. Vaney, University of Queensland.)

 

 

 

очень важны для прослеживания прохождения аксонов из одной части нервной системы в другую.

Для описания специфических нейронов, дендритов и синапсов путем избирательного маркирования внутриклеточных или мембранных компонентов используют антитела. На рис. 1.5 показана группа специфических биполярных клеток, маркированных антителом к ферменту фосфокиназа С. Антитела успешно применяются для прослеживания миграции и дифференциации нервных клеток в онтогенезе. Дополнительным подходом для описания нейронов является гибридизация in situ: специфически меченые зонды маркируют мРНК нейрона, которая кодирует синтез канала, рецептора, передатчика или структурного элемента.

Ненервные элементы мозга

Отчетливо видна клетка, помеченная буквой M на рис. 1.2В, представляющая собой ненервную клетку, находящуюся в сетчатке. Такие клетки известны как глиальные клетки. В отличие от нейронов, у них нет аксонов или дендритов и они не связаны напрямую с нервными клетками. Глиальных клеток очень много в нервной системе. Они выполняют много разных функций, связанных с передачей сигнала. Например, аксоны ганглиозных клеток сетчатки, составляющие оптический нерв, проводят импульсы очень быстро, потому что они окружены изолирующей липидной оболочкой, называемой миэлин. Миэлин формируется глиальными клетками, которые оборачиваются вокруг аксонов при онтогенетическом развитии. Глиальные клетки сетчатки известны как мюллеровские клетки.


20                                                                   Раздел I. Введение

Группировка клеток в соответствии с функцией

Замечательным свойством сетчатки является расположение клеток в соответствии с функцией (см. рис. 1.2). Клеточные тела фоторецепторов, горизонтальных, биполярных, амакриновых и ганглиозных клеток расположены отчетливыми слоями. Подобная слоистость наблюдается повсеместно в мозге. Например, структура, в которой волокна оптического нерва заканчиваются (латеральное коленчатое тело), состоит из 6 слоев клеток, которые легко различить даже невооруженным глазом. Во многих областях нервной системы клетки со сходными функциями сгруппированы в отчетливые шарообразные структуры, известные как ядра (не путайте с ядром клетки) или ганглии (не путайте с ганглиозными клетками сетчатки).

Подтипы клеток и функция

Упрошенное представление структуры сетчатки на рис. 1.2 не отражает некоторых свойств сетчатки. Существует несколько отчетливых типов ганглиозных, горизонтальных, биполярных и амакриновых клеток, каждый из которых обладает характерной морфологией, специфичностью медиатора и физиологическими свойствами. Например, фоторецепторы разделяются на два легко различимых класса — палочки и колбочки, — которые выполняют различные функции. Удлиненные палочки исключительно чувствительны к малейшим изменениям в освещении. Когда вы читаете эту страницу, рассеянный свет слишком ярок для палочек, которые функционируют только в слабом свете после длительного периода в темноте. Колбочки отвечают на зрительные стимулы в ярком свете. Более того, колбочки далее подразделяются на подтипы фоторецепторов, чувствительные к красному, зеленому или синему цвету. Амакриновые клетки являются ярким примером клеточного разнообразия: более 20 типов может быть выделено по структурным и физиологическим критериям.

Таким образом, сетчатка иллюстрирует глубочайшие проблемы современной нейробиологии. Неизвестно, для чего нужно столько типов амакриновых клеток и какие разные функции выполняет каждый из этих типов клеток. Отрезвляет сознание того, что функция подавляющего большинства нервных клеток центральной, периферической и висцеральной нервной системы неизвестна. В то же время это неведение подсказывает, что многие основные принципы роботы мозга еще не поняты.

Конвергенция и дивергенция связей

Стрелками на рис. 1.2А показано направление передачи сигнала от рецепторов к ганглиозным клеткам. В реальности картина существенно более сложная. Например, наблюдается сильное уменьшение количества вовлеченных клеток на пути от рецепторов к ганглиозным клеткам. Выходы более чем 100 миллионов рецепторов конвергируют на 1 миллионе ганглиозных клеток, аксоны которых составляют оптический нерв. Таким образом, многие (но не все) ганглиозные клетки получают входы от большого количества фоторецепторов (конвергенция) через вставочные клетки. В свою очередь, одна ганглиозная клетка интенсивно ветвится и оканчивается на многих клетках-мишенях (дивергенция, см. рис. 1.13).

Кроме того, в отличие от упрошенной схемы на рис. 1.2А, стрелки должны показывать в стороны для обозначения взаимодействия между клетками в одном слое (латеральные связи) и даже в противоположные стороны — например, назад от горизонтальных клеток к фоторецепторам (возвратные связи). Такие конвергентные, дивергентные, латеральные и возвратные влияния являются постоянными свойствами большинства нервных путей по всей нервной системе. Таким образом, простая пошаговая обработка сигнала затруднена параллельными и обратными взаимодействиями.

§ 2. Сигналы нервных клеток

Для анализа событий во внешнем мире или внутри нашего тела, для передачи информации от клетки к клетке нейроны используют электрические и химические сигналы. Расстояние передачи сигнала может быть большим: от кончиков пальцев на ногах до спинного мозга. Различные сигналы прекрасно представлены все в той же сетчатке. В то время, когда Рамон-и-Кахаль рисовал стрелки на рис. 1.2А, почти не было информации об этих сигналах, что делает его достижения еще более примечательными.


Глава 1. Передача информации и структурная организация мозга                             21

Ступени переработки информации можно последовательно проследить: свет падает на фоторецепторы и генерирует электрические сигналы, которые воздействуют на биполярные клетки. От биполярных клеток сигналы передаются к ганглиозным клеткам и от них к высшим центрам мозга, которые и осуществляют восприятие внешнего мира. В следующих разделах рассматриваются свойства сигналов и пути переработки информации.

Классы электрических сигналов

Электрические сигналы нервных клеток могут быть разделены на два основных класса. Во-первых, это локальные градуальные потенциалы (см. рис. 1.8), которые вызываются такими внешними стимулами, как свет, падающий на фоторецепторы глаза, звуковая волна, деформирующая волосковые клетки уха, или прикосновение, механически смещающее отросток сенсорной клетки в коже. Сходны по характеристикам, но существенно отличаются по происхождению сигналы, генерируемые в синапсах — соединениях между клетками, которые мы обсудим позже. Все эти сигналы градуальны и привязаны к месту возникновения, а их распространение зависит от пассивных характеристик нервных клеток.

Потенциалы действия составляют вторую основную категорию (см. рис. 1.9). Потенциалы действия вызываются локальными градуальными потенциалами. В отличие от локальных потенциалов, они быстро распространяются на большие расстояния — например, от глаза до высших центров по волокнам ганглиозных клеток, составляющих оптический нерв, или от моторных клеток в спинном мозге к мышцам ноги. Второе отличие потенциалов действия состоит в том, что они фиксированы по амплитуде и длительности, как точки в азбуке Морзе. Крайне существенно понимать, что потенциалы действия, путешествующие по волокнам оптического нерва не являются эпифеноменами, присутствующими лишь в наших представлениях о работе мозга. Они являются единственной формой сигнализации, которая снабжает мозг информацией о внешнем мире.

Передача сигнала от сетчатки может быть представлена следующей упрощенной схемой:

Свет



Локальный градуальный сигнал в фоторецепторе



Локальный градуальный сигнал в биполярной клетке



Локальный градуальный сигнал в ганглиозной клетке



Потенциал действия в ганглиозной клетке



Проведение сигнала к высшим центрам.

Универсальность электрических сигналов

Важным свойством электрических сигналов является то, что они фактически идентичны во всех нервных клетках организма независимо от того, запускают ли они движение, передают ли информацию о цветах, формах или болезненных стимулах, или соединяют различные области мозга. Вторым важным свойством сигналов является то, что они настолько одинаковы у разных животных, что даже умудренный опытом исследователь не способен точно отличить запись потенциала действия от нервного волокна кита, мыши, обезьяны или профессора. В этом смысле потенциалы действия могут считаться стереотипными единицами. Они являются универсальным эталоном для обмена информацией во всех исследованных нервных системах. В мозге не типы сигналов, а огромное количество клеток (от 1010 до 1012 нейронов) и разнообразие связей обеспечивают сложность выполняемых задач.

Эта идея была высказана в 1868 году немецким физиком и биологом Германом фон Гельмгольцем. Беря за основу гипотетические принципы, задолго до обнаружения известных сейчас фактов, он писал2):

Нервные волокна часто сравнивают с телеграфными проводами, пересекающими местность, и это сравнение хорошо приспособлено для иллюстрации удивительных и важных особенностей их образа действия. В телеграфной сети везде мы обнаруживаем те же медные или стальные провода, несущие только один вид движения, поток электричества, но вызывающие самые разные результаты на разных станциях в соответствии с дополнительной аппаратурой, с которой провода соединены. На одной станции эффект состоит в звонке колокольчика, на другой сигнал просто передается дальше, на третьей вступает в работу записывающий аппарат. ...Говоря коротко, каждое из... различных действий, вызываемых


22                                                                        Раздел I. Введение

Рис. 1.6.   Техника   регистрации электрической активности. (А) Кончик тонкого металлического электрода расположен близко к нервной  клетке в коре.  (В)   Внутриклеточная регистрация производится заполненной  проводящей жидкостью стеклянной микропипеткой, введенной в клетку. (С) Внутриклеточное отведение также делается пэтч-пипеткой, которая прилипает к клеточной мембране.

Fig. 1.6. Electrical Recording Techniques. (A) The tip of a fine wire electrode is located close to a nerve cell in the cortex. (The wire above the tip is insulated.) Extracellular recording allows one to record from a single cell or from a group of cells. (B) Intracellular recordings are made with a fluid-filled glass capillary that has a tip of less than 1 /urn in diameter, which is inserted into a neuron across the cell membrane. At rest there is a potential difference of about 70 mV, the inside negative with respect to the outside. This difference is known as the resting potential. (C) Intracellular recordings are also made with patch electrodes. A patch electrode has a larger tip than that of an intracellular microelectrode; the tip makes an extremely tight seal with the cell membrane. If the seal is intact the currents that flow as a single ion channel in the membrane opens or closes can be recorded. Alternatively, as shown here, the cell membrane can be ruptured to allow the diffusion of molecules between the pipette and the intracellular fluid of the cell (whole-cell patch clamp).

электричеством, может быть вызвано и передана проводом в любую необходимую точку. При этом β проводе происходит один и тот же процесс, приводящий к самым разным последствиям. ...Та разница, которую мы видим при возбуждении различных нервов, заключается только в рознице самих органов, к которым присоединен нерв и которым передается состояние возбуждения.

На самом деле, как будет показано в главе 6, небольшая разница в амплитуде и длительности очевидна в потенциалах действия разных нейронов. Утверждение, что все потенциалы действия одинаковы, равносильно утверждению, что все дубы одинаковы.

Техника записи сигналов от нейронов с помощью электродов

Для решения некоторых задач существенно регистрировать активность одного нейрона или даже одного ионного канала, тогда как для других задач необходима суммарная активность многих нейронов. Ниже коротко суммируются основные приемы для записи активности нейронов, используемые для обсуждения в следующих главах.

Впервые запись потенциалов действия от нерва была сделана от периферических нервов экстра клеточным и электродами. Пропускание тока между парой серебряных проводников вызывало потенциал действия, тогда как вторая пара таких же электродов на некотором расстоянии регистрировала ответ. В центральной нервной системе регистрация от нейрона или группы нейронов производится экстраклеточным электродом, который состоит из проводника в изолирующей оболочке или из стеклянного капилляра, заполненного проводящим солевым раствором (рис. 1.6А).

С помощью внутриклеточного микроэлектрода мы можем прямо измерять разницу потенциала между наружной и внутренней средой клетки, так же как возбуждение, торможение и возникновение импульсов. Стеклянный микроэлектрод, заполненный солевым раствором и с кончиком менее 0,1 мм в диаметре, вводится в клетку с помощью микроманипулятора (рис. 1.6В). Микроэлектроды также используют для пропускания тока через мембрану или внутриклеточной инъекции молекул в цитоплазму.


Глава 1. Передача информации и структурная организация мозга                          23

Часто используется прием измерения мембранного потенциала, известный как пэтч-кламп целой клетки. Стеклянная пипетка со сравнительно большим полированным кончиком придвигается к поверхности клетки, где она прилипает к мембране и образует прочное соединение. После нарушения целостности мембраны внутри пипетки жидкость в пипетке прямо контактирует с внутриклеточной жидкостью.

Неинваэивные методы регистрации нейронной активности

Используя метод оптической регистрации, можно проследить передачу информации в некоторых препаратах мозга без использования электродов. Специально созданные красители, которые связываются с клеточной мембраной, изменяют абсорбцию проходящего света или флуоресценцию при изменениях мембранного потенциала клетки, что можно объективно регистрировать. Существуют и такие неинвазивные методы, как позитронно-эмиссионная томография и магнитно-резонансная томография (МРТ), которые позволяют определить, какие области мозга бодрствующего человека активизируются при предъявлении стимулов или при движении. Получаемое с помощью МРТ изображение на рис. 1.7 показывает области, активируемые при предъявлении зрительного стимула.

Ретинограмма отражает суммарную активность сетчатки, электроэнцефалограмма — суммарную активность мозга. Эти методы в основном используются для диагностики нарушений функций мозга.

Распределение локальных градуальных потенциалов и пассивные электрические свойства нейронов

В схемах Рамона-и-Кахаля, отображающих клеточное строение мозга (см. рис. 1.2А), просвечивает идея о том, что освещение сетчатки изменяет активность фоторецепторов и эти изменения отражаются в активности нервных волокон, выходящих из глаза. Для такой передачи информации сигналы должны распространяться не только от клетки к клетке, но и вдоль клетки, от одного ее конца до другого. Как, например, электрический сигнал, генерируемый на контактирующем с фоторецептором конце биполярной клетки, распространяется вдоль нейрона и достигает терминали, которая расположена около ганглиозной клетки?

Для того чтобы ответить на этот вопрос, полезно рассмотреть соответствующие структуры, которые передают сигналы. Биполярную клетку можно рассматривать как длинный цилиндр, наполненный водным раствором солей (диссоциированных на положительно и отрицательно заряженные ионы) и белков, отделенный от экстраклеточного раствора мембраной. Внутриклеточный и экстраклеточный растворы осмотически одинаковы, но имеют разный ионный состав. Ионы двигаются по специальным ионным каналам, которые образованы белковыми молекулами, пронизывающими мембрану. Электрические и химические стимулы вызывают открытие или закрытие каналов для ионов кальция, натрия, калия и хлора.

В результате различий в концентрации ионов по обе стороны мембраны и из-за избирательности каналов для определенных ионов образуется потенциал покоя клетки. В покое внутреннее содержимое клетки отрицательно заряжено по отношению к наружной среде (см. рис. 1.6). Детальная информация о молекулярной структуре ионных каналов и принципов прохождения через них ионов дана в главе 2.

Строение и свойства нейрона определяют способность проведения электрических сигналов. Во-первых, внутриклеточная жидкость, цитоплазма (аксоплазма в отростке клетки, аксоне) примерно в 107 раз хуже проводит электричество, чем металлический проводник. Одной из причин является то, что плотность переносчиков заряда, ионов, в несколько раз меньше, чем электронов в металле; кроме того, подвижность ионов невелика. Во-вторых, протекание тока вдоль аксона на большое расстояние осложняется тем, что мембрана не является идеальным изолятором. Соответственно, величина тока, текущего вдоль волокна, быстро уменьшается из-за утечки через ионные каналы мембраны. Тот факт, что нервные волокна очень малы (обычно не более 20 микрон (мкм) в диаметре у позвоночных), еще больше уменьшает количество проводимого тока. Алан Ходжкин дал интересную иллюстрацию этих свойств распространения электрического сигнала3) ·

Если специалист по электричеству посмотрит на нервную систему, то сразу увидит, что передача сигнала по нервным волокном является огромной проблемой. Диаметр аксона в нерве


24                                                                  Раздел I. Введение

Рис. 1.7. Изображение живого мозга с помощью МРТ.

Fig. 1.7. Magnetic Resonance Imaging of Living Brain. The subject was presented with visual stimuli that caused activity to be generated in the lateral geniculate nucleus (labeled with the bounded arrow) deep within the brain (see Figure 1.1 and Chapter 20) and the visual cortex. The color represents the level of activity, white corresponding to high and grey to low. (After Ugurbil et al., 1999; image kindly provided by K. Ugurbil.)

 

варьирует от 0,1 до 20 микрон. Внутреннее содержимое содержит ионы и является неплохим проводником электричества. Однако, волокно невелико и его продольное сопротивление очень высоко. Простой расчет показывает, что в волокне диаметром 1 микрон и сопротивлением 100 Ом/см удельное сопротивление составит около 1010 Ом/см. Это означает, что электрическое сопротивление маленького нервного волокна длиной в 1 метр равно сопротивлению 1010 миль 0,2 мм медной проволоки, то есть проволоки длиной в десять раз больше, чем от Земли до планеты Сатурн.

Таким образом, пассивное проведение электрических сигналов затруднено и ограничено расстоянием 1-2 мм. Кроме того, когда такой сигнал короток, его форма может быть сильно искажена и его амплитуда еще уменьшена емкостью клеточной мембраны. Тем не менее, локальные потенциалы очень важны для вызова и проведения распространяющегося сигнала.

Распространение изменений потенциала в биполярных клетках и фоторецепторах

Фоторецепторы и биполярные клетки невелики по длине, поэтому локальный градуальный сигнал может эффективно распространяться от одного конца клетки до другого. Электрический сигнал, который отражает попадание света на фоторецептор, генерируется в наружном сегменте палочек или колбочек. Оттуда сигнал пассивно распространяется вдоль клетки до терминали на биполярной клетке. Если бы рецептор или биполярная клетка были длиннее (несколько миллиметров в длину), то локальный потенциал из-за сильного ослабления не достиг бы терминали и не смог влиять на следующую в цепи клетку. Биполярные клетки и фоторецепторы представляют собой исключение из общего правила, которое гласит, что для переноса информации вдоль нейрона необходимы потенциалы действия. Ганглиозные клетки обладают длинным (несколько сантиметров) аксоном и поэтому должны генерировать потенциалы действия для эффективного распространения сигнала в оптический нерв. Записи активности, показанные на рис. 1.8, сделаны от тел клеток. Локальные потенциалы возникают на дендритах в результате синаптических воздействий и пассивно распространяются к месту отведения.

Свойства потенциалов действия

Одним из основных свойств потенциала действия является то, что это взрывное, пороговое событие, возникающее по закону «все-или-ничего». Потенциал действия возникает в ганглиозной клетке в тех случаях, когда приходящие от биполярных и амакриновых клеток сигналы достигают некоторого критического уровня (порога) мембранного потенциала. У потенциала действия (ПД) есть четко определенный порог, после достижения которого амплитуда и длительность ПД не зависят от параметров стимуляции. Большие по амплитуде стимулы не вызывают большие по амплитуде ПД, равно как и длинные стимулы не приводят к появлению более длинных ПД.


Глава 1. Передача информации и структурная организация мозга                           25

Рис. 1.8. Локальные градуальные потенциалы.

Fig. 1.8. Localized   Graded   Potentials Intracellular recordings are made from (A) a bipolar cell and (B) a ganglion cell with microelectrodes. (A) When light is absorbed by the photoreceptors, it gives rise to a signal that in turn produces a localized graded response in the bipolar cell. The resting potential across the membrane is reduced (the trace moves in an upward direction). This effect is known as a depolarization. The size of the signal in the bipolar cell depends on the intensity of illumination, hence the term "graded". The depolarization spreads to the far end of the bipolar cell passively. As it spreads, it becomes smaller in amplitude owing to the poor conducting properties of neurons. At the terminal of the bipolar cell the depolarization causes the release of the chemical transmitter. (B) The transmitter produces a local graded potential in the ganglion cell. Because it is localized, the potential cannot spread for more than 1 mm (at most) along the axon. Whereas the bipolar cell is short enough for a local potential to spread to its endings, the ganglion cell has an axon several centimeters long. In these illustrations the local potentials were recorded from the cell bodies and were produced by transmitters acting on the dendrites. (A after Kaneko and Hashimoto, 1969; В after Baylor and Fettiplace, 1977.)

На рис. 1.9 показано, что ПД представляет собой короткий электрический импульс амплитудой около 0,1 В. Длительность ПД около 1 миллисекунды (мс), и он быстро движется вдоль нервного волокна от одного конца к другому.

Все фазы ПД должны быть полностью закончены до начала возникновения следующего ПД. После каждого ПД существует период вынужденного молчания (рефрактерный период), во время которого инициация ПД невозможна. Частота ритмических ПД определяется рефрактерным периодом.

Распространение ПД вдоль нервных волокон

Каждый импульс вызывает электрические токи, распространяющиеся пассивно перед ним по аксону. Хотя результирующий локальный потенциал быстро угасает с расстоянием, он все же превышает порог. Таким образом, ПД производит электрический стимул области ак-


26                                                                   Раздел I. Введение

Рис. 1.9. Регистрация потенциала   действия   ганглиозной   клетки  сетчатки внутриклеточным микроэлектродом.

Fig. 1.9. Action Potential recorded from a retinal ganglion cell with an intracellular microelectrode. When the stimulus, in this case current injected into the cell through the microelectrode, causes a depolarizing response that exceeds the threshold, the all-or-nothing action potential is initiated. During the action potential the inside of the neuron becomes positive. The action potential propagates along the axon of the ganglion cell to its terminal where it causes transmitter to be released. (After Baylor and Fettiplace, 1977.)

сома, в которую будет распространяться. Наиболее быстрые ПД распространяются по волокнам большого диаметра со скоростью около 120 метров в секунду (430 км/час), что и определяет возможность быстрой передачи информации на большие по сравнению с размером тела клетки расстояния.

ПД как нейронный код

Учитывая, что каждый ПД имеет фиксированную амплитуду, неясно, в чем же отражается величина стимула. Интенсивность кодируется частотой ПД. Более эффективный зрительный стимул вызывает большую деполяризацию и, как следствие, более высокую частоту генерации ПД в ганглиозной клетке (рис. 1.10). Такое обобщение впервые было сделано Е. Эдрианом4), который показал, что частота ПД в чувствительном окончании кожного нерва зависит от интенсивности стимула. Кроме того, он обнаружил, что более сильный стимул активирует большее количество чувствительных волокон.

Синапсы: области межклеточной коммуникации

Фоторецепторы влияют на биполярные клетки, которые влияют на ганглионарные клетки и так далее, что в конечном счете приводит к восприятию зрительного образа. Структура, через которую одна клетка передает информацию другой, известна как синапс. Механизм синаптической передачи представляет собой основную тему исследований в современной нейробиологии. Через синаптические взаимодействия нейроны, подобные ганглиозной клетке, интегрируют информацию о сигналах во многих фоторецепторах, производя на выходе новый собственный информационный сигнал для нервной сети.

Химически опосредованная синаптическая передача

На рис. 1.11 показана сложно организованная структура, с помощью которой фоторецептор контактирует с биполярными клетками. Пресинаптическая терминаль фоторецептора отделена от биполярной клетки щелью, заполненной экстраклеточной жидкостью. Это пространство слишком велико для прохождения токов, генерируемых фоторецептором. Вместо этого терминаль фоторецептора выделяет медиатор (иначе, трансмиттер или нейропередатчик), который хранится в пресинаптических пузырьках. Медиатор (в данном случае глутамат) диффундирует через синаптическую щель и реагирует со специфическими молекулами белка (рецепторами), которые находятся в постсинаптической мембране биполярной


Глава 1. Передача информации и структурная организация мозга                           27

 

Рис. 1.10. Частота как показатель интенсивности сигнала в ганглиозной клетке сетчатки.

Fig. 1.10. Frequency as a Signal of Intensity in a retinal ganglion cell. Depolarizing current passed through the microelectrode produces local potentials. Larger currents produce larger local potentials and higher frequencies of firing. (After Baylor and Fettiplace, 1979.)

Рис. 1.11. Структура синапса. (А) Основные свойства синапса между фоторецептором и биполярной клеткой. (В) Электронная микрофотография типичного синапса в сетчатке обезьяны.

Fig. 1.11. Structure of a Synapse. (A) These drawings show the principal features of synaptic structures made by a photoreceptor on a bipolar cell. (B) This electron micrograph shows the appearance of a typical synapse in the retina of a macaque monkey. The vesicles that store transmitter are in the presynaptic terminal; a narrow cleft separates the pre- and postsynaptic membranes. The postsynaptic membrane is densely stained. Transmitter released from the presynaptic amacrine cell diffuses across the cleft to interact with receptors on the postsynaptic ganglion cell. (Micrograph kindly provided by Y. Tsukamoto and P. Sterling.)

клетки. Следует отличать «хеморецепторы», реагирующие на молекулы, и «сенсорные рецепторы», реагирующие на внешние стимулы, например, фоторецептор. Медиаторы, синтезируемые и выделяемые нейроном, и рецепторы мембраны могут быть идентифицированы и визуализованы некоторыми методиками, включающими мечение антителами.

Активация молекул рецепторов биполярной клетки глутаматом приводит к появлению градуального локального потенциала, который распространяется по нейрону. Чем больше медиатора выделяется, тем выше его концентрация в щели, тем больше рецепторов активируется и тем больше локальный потенциал. Все эти события происходят быстро, примерно за 1 мс. Основные принципы синаптической передачи были впервые описаны Катцом, Куффлером и соавторами5), которые использовали ответы мышечных рецепторов как очень чувствительную биомодель с хорошим разрешением по времени для измерения выделения медиатора.

Возбуждение и торможение

Особенностью синаптической передачи, продемонстрированной на примере взаимодействия между фоторецептором и биполярной клеткой, является возможность торможения


28                                                                   Раздел I. Введение

 

Рис. 1.12. Возбуждение и торможение. (А) Возбуждение ганглиозной клетки при освещении сетчатки. (В] Освещение другой группы фоторецепторов вызывав! торможение, выражающееся в гиперполяризации и отдалении от порога генерации потенциала действия.

Ид. 1.12. Excitation and Inhibition. Intracellular recordings from a ganglion cell showing excitatory and inhibitor) synaptic potentials. (A) A ganglion cell is depolarized bj continuous release of excitatory transmitter during retinal illumination. If  the depolarizing synaptic potential i; large enough, threshold is crossed and action potential· are initiated in the ganglion cell. (B) Illumination ol a different group of photoreceptors causes inhibition Hyperpolarization of the membrane makes it more dif ficult to initiate an action potential. (After Baylor anc Fettiplace, 1979.)

или возбуждения в зависимости от набора рецепторов в постсинаптической клетке. Например, один из видов глутаматных рецепторов на биполярной клетке реагирует на глутамат возбуждением (деполяризацией), которое распространяется до терминалей на другом конце клетки и приводит к высвобождению медиатора. Другой класс биполярных клеток содержит глутаматные рецепторы другого вида, которые реагируют торможением. В этом случае события происходят в той же последовательности, но приводят к уменьшению выброса медиатора. Примеры возбудительных и тормозных потенциалов в ганглиозной клетке показаны на рис. 1.12.

Во всех нейронах нервной системы соотношение возбудительных и тормозных входов определяет возможность достижения порога инициации потенциала действия. Например, ганглиозная клетка получает и возбудительные, и тормозные входы. Если порог преодолен, то новый сигнал в виде ПД будет послан к высшим центрам, если нет, то сигнала не будет. В моторных клетках спинного мозга, например, возбудительные и тормозные влияния от разных волокон определяют, будет или нет произведено движение, контролируемое данными мотонейронами. Подобные мотонейроны получают около 10000 входов от волокон (рис. 1.1 3А). Эти волокна выделяют медиаторы, которые приближают или отдаляют от порога возникновения ПД мембранный потенциал. Отдельные клетки в мозжечке получают более чем 100000 входов.

Электрическая передача

Хотя основной способ передачи информации осуществляется через химическую передачу, некоторые клетки в сетчатке и других областях нервной системы связаны специализированными соединениями, в которых происходит электрическая передача информации. Пре- и постсинаптические мембраны в таких соединениях близко расположены и связаны каналами, которые соединяют внутриклеточное содержимое двух клеток. Такое соединение позволяет локальным потенциалам и даже потенциалам действия прямо распространяться от клетки к клетке без химического передатчика. Продукты метаболизма и красители также могут распространяться от клетки к клетке. В сетчатке есть так называемые горизонтальные клетки, которые электрически связаны таким способом. Благодаря этому свойству градуальные потенциалы могут распространяться от одной к другой горизонтальной клетке, сильно влияя на процесс переработки зрительной информации в сетчатке. Электрические синапсы обнаружены и между другими клетками тела, например между эпителиальными клетками, мышечными волокнами кишечника и сердца.


Глава 1. Передача информации и структурная организация мозга                           29

Рис. 1.13. Множественные связи отдельных нейронов. (А) Примерно 10000 пресинаптических аксонов конвергируют и образуют синаптические окончания на поверхности мотонейрона спинного мозга. (В) Дивергенция аксона одной горизонтальной клетки.

Fig. 1.13. Multiple Connections of Individual Neurons. (A) Approximately 10 000 presynaptic axons converge to form endings that are distributed over the surface of a motor neuron in the spinal cord. This drawing is based on a reconstruction made from electron micrographs. (B) This drawing shows the divergence of the axon of a single horizontal cell that branches extensively to supply many postsynaptic target cells. (A from Poritsky, 1969; В after Fisher and Boycott 1974.)

Модуляция синаптической эффективности

Химически опосредованная синаптическая передача информации очень лабильна. Основные изменения происходят в количестве медиатора, выделяемого при достижении пресинаптической терминали потенциалом действия или градуальным потенциалом. Фоторецептор сетчатки может служить примером: количество медиатора глутамата, выделяемого палочкой или колбочкой в ответ на стандартный световой стимул, может быть увеличено или уменьшено в зависимости от обратной связи на терминаль от горизонтальных клеток, которые получают входы от фоторецепторов. Эта цепь обратной связи играет критическую роль в адаптации глаза к различным уровням освещения.

Другие механизмы, влияющие на величину выброса медиатора, зависят от предыстории импульсной активности. Во время или после залпа импульсов в нейроне количество выделяемого им медиатора может существенно увеличиваться или уменьшаться в зависимости от частоты и длительности предшествуюшей импульсной активности. Модуляция эффективности может происходить и в постсинапсе. Долговременная и кратковременная пластичность находится в фокусе внимания нейробиологов.

Интегративные механизмы

Каждый нейрон в центральной нервной системе учитывает все приходящие влияния и на их основе создает свое импульсное «послание» с новым значением. Термин интеграция впервые был применен Ч. Шеррингтоном 6), который также ввел в обиход термин «синапс».

Ганглиозные клетки сетчатки опять же могут служить примером способности к интеграции. С. Куффлер7) впервые показал, что ганглиозные клетки отвечают наиболее сильно на небольшое световое или темновое пятно размером в несколько рецепторов в определенной области сетчатки. Такое пятно вызывает отчетливый залп потенциалов действия (рис. 1.14А). Большое пятно, освещающее ту же область сетчатки, менее эффективно. Это происходит потому, что другая группа фоторецепторов, расположенная вокруг активированных, также реагирует на свет. Действие этих фоторецепторов тормозит активность ганглиозных клеток (рис. 1.14В). Суммация возбуждающего действия маленького пятна и тормозный эффект расположенных вокруг рецепторов приводят к тому, что ганглиозные клетки относительно слабо чувствительны к диффузному свету (рис. 1.14С).

Таким образом, значение сигнала ганглиозной клетки не просто отражает «свет» или «темноту», но и соотносится с паттерном кон-


30                                                                   Раздел I. Введение

Рис. 1.14.    Интеграция  информации ганглиозными клетками. (А) Небольшое пятно света вызывает сильный разряд клетки. (В) Свет в виде кольца тормозит ганглиозную клетку. (С) Освещение всех фоторецепторов приводит к слабому разряду клетки.

Fig. 1.14. Integration by Ganglion Celts. Extracellular recordings made from a single ganglion cell in the retina of a lightly anesthetized cat while patterns of light were presented to the eye (see Figure 1.15). (A) A small spot of light presented to a centrally located group of photoreceptors gives rise to excitation and a brisk discharge of action potentials. (B) Light presented as a ring, or annulus, to illuminate a circumferential group of photoreceptors gives rise to inhibition of the ganglion cell which prevents the cell from firing. Removal of the inhibition at the end of illumination is equivalent to excitation, which gives rise to a burst of action potentials. (C) Illumination of both groups of receptors causes integration of excitation and inhibition and a weak discharge of action potentials. (After Kuffler, 1953.)

трастности светового стимула в поле зрения. Такой сложный сигнал возникает из-за того, что на каждую ганглиозную клетку приходят сигналы от многих фоторецепторов. Специфические связи, опосредованные биполярными, горизонтальными и амакриновыми клетками, определяют специфический паттерн светового стимула, оптимальным образом активирующий каждую конкретную ганглиозную клетку.

Сложность информации, передаваемой потенциалами действия

Еще более сложную информацию о зрительных стимулах несут ПД нервных клеток новой коры, получающих сигнал через три переключения после сетчатки 8). Появление ПД в нейронах коры зависит от паттерна освещения сетчатки, который может быть специфичным для разных клеток. Например, один тип клеток избирательно отвечает на полоску света специфической ориентации (вертикальная, горизонтальная или наклонная), которая движется в определенном направлении в определенной части поля зрения (рис. 1.15). Параметры разрядов такой клетки не зависят от диффузного освещения или от появления полоски неоптимальной ориентации, или от движения в неправильном направлении. Таким образом, ПД в таком нейроне дают точную информацию о зрительном стимуле в высшие центры мозга. Подобная детализация значения, передаваемая стереотипными ПД, может быть объяснена точностью образования связей между клетками низкого порядка с кортикальными клетками и способом интеграции входных сигналов (суммация градуальных потенциалов).

Переработка информации может быть представлена в следующем виде:

сигнал фоторецептора несет информацию об изменении интенсивности освещения в данной области поля зрения;

сигнал ганглиозной клетки несет информацию о контрасте;

сигнал кортикального нейрона несет информацию о наличии ориентированной полоски света.

Сложная интеграция информации происходит в других сенсорных системах. Например, направление и локализация механиче-


Глава 1. Передача информации и структурная организация мозга                           31

 

Рис. 1.15. Передача информации потенциалами действия. (А) Ответ клетки зрительной коры кошки на предъявление вертикальной полоски света. (В-Е) Ответы на стимулы другой ориентации.

Fig. 1.15. Information Conveyed by Action Potentials. Extracellular recordings from a neuron in the cerebral cortex of a lightly anesthetized cat. Action potentials in this cell indicate that a bar of light that is almost vertical shines on one particular part of the visual field. The small drawings to the left of the graphs show how visual stimuli such as bars or edges with different orientations and positions are presented to the eye. (A) The cortical cell fires a burst of action potentials when the light stimulus consists of a vertical bar of light in one particular part of the visual field. (B-E) Bars with different orientations or diffuse light fail to evoke action potentials. The cortical cell integrates information arriving by way of relays from a large number of photoreceptors, some of which (corresponding to those illuminated by the vertical bar) give rise to excitation on the cortical cell, the others giving rise to inhibition. (After Hubel and Wiesel, 1959.)

ского стимула кончиков пальцев служат избирательным стимулом для конкретных нейронов той области неокортекса, в которой происходит переработка информации о направлении тактильной стимуляции.

Можно сделать два важных заключения о принципах переработки информации в нервной системе: (1) нервные клетки играют роль составляющих элементов для «построения» восприятия; (2) значение сигнала нейрона может быть очень сложным и зависеть от входных сигналов.

§ 3. Клеточная и молекулярная биология нейронов

Как и другие типы клеток организма, нейроны в полной мере обладают клеточными механизмами метаболической активности, синтеза белков мембраны (например, белков ионных каналов и рецепторов). Более того, белки ионных каналов и рецепторов направленно транспортируются к местам локализации в клеточной мембране. Специфичные для натрия или калия каналы расположены на мембране аксонов ганглиозных клеток дискретными группами (кластерами). Эти каналы участвуют в инициации и проведении ПД.

Пресинаптические терминали, образованные отростками фоторецепторов, биполярных клеток и других нейронов, содержат в своей мембране специфические каналы, через которые могут проходить ионы кальция. Вход кальция запускает выделение медиатора. Каждый тип нейронов синтезирует, хранит и выделяет определенный вид медиатора(ов). В отличие от многих других белков мембраны, рецепторы для специфических медиаторов расположены в точно определенных местах — постсинаптических мембранах. Среди белков мембраны известны также белки-насосы или транспортные белки, роль которых заключается в сохранении постоянства внутреннего содержимого клетки.

Основным отличием нервных клеток от остальных видов клеток организма является наличие длинного аксона. Так как в аксонах нет биохимической «кухни» для синтеза белков, все основные молекулы должны переноситься к терминалям с помощью процесса, называемого аксональным транспортом, причем часто на очень большие расстояния. Все молекулы, необходимые для поддержания структуры и функции, равно как и молекулы


32                                                                  Раздел I. Введение

Рис. 1.16. Генетические влияния на развитие глаз у дрозофилы. Ген eyeless контролирует развитие глаз у дрозофилы. Повышенная экспрессия гена приводит к появлению морфологически нормальных эктопических глаз (А, В) в разных частях тела мушки.

fig. 1.16. Genetic Influences on Development of the Eye in the fruit fly, Drosophila. A gene known as eyeless controls development of the eye in the fruit fly. After deletion of this gene, eyes fail to appear. Overexpression leads to the development of ectopic eyes that are morphologically normal. (A) This scanning electron micrograph shows such ectopic eyes on the antenna (arrowhead) and on the wing (arrow). (B) Here the wing eye is shown at higher magnification. A gene with strikingly similar sequence homology in the mouse also leads to the formation of ectopic eyes in the fly if it is overexpressed. (After Haider, Callaerts, and Gehring, 1995; micrographs kindly provided by W. Gehring.)

мембранных каналов, путешествуют от тела клетки этим путем. Точно так же и молекулы, захваченные мембраной терминалей, проделывают обратный путь к телу клетки, используя аксональный транспорт.

Нейроны отличаются от большинства клеток еше и тем, что, за небольшим исключением, не могут делиться. Это означает, что у взрослых животных погибшие нейроны не могут быть заменены.

§4. Регуляция развития нервной системы

Высокая степень организации такой структуры, как сетчатка, ставит новые проблемы. Если для сборки компьютера необходим человеческий мозг, то никто не контролирует мозг во время развития и установления его связей. Пока еще остается загадкой, как правильная «сборка» частей мозга приводит к появлению его уникальных свойств.

В зрелой сетчатке каждый тип клеток расположен в соответствующем слое или подслое и образует строго определенные связи с соответствующими клетками-мишенями. Такое устройство является необходимым условием правильного функционирования. Например, для развития нормальных ганглиозных клеток клетка-предшественник должна разделиться, мигрировать в определенное место, дифференцироваться в определенную форму и образовать специфические синаптические связи.

Аксоны этой клетки должны найти через значительное расстояние (оптический нерв) определенный слой клеток-мишеней в следующем звене синаптического переключения. Аналогичные процессы происходят во всех отделах нервной системы, в результате чего образуются сложные структуры со специфическими функциями.

Исследование механизмов образования таких сложных структур, как сетчатка, является одной из ключевых проблем современной нейробиологии. Понимание того, каким образом сложные взаимосвязи нейронов образуются в процессе индивидуального развития (онтогенезе), может помочь описать свойства и происхождение функциональных расстройств мозга. Некоторые молекулы могут играть ключевую роль в дифференциации, росте, миграции, образовании синапсов и выживании нейронов. Такие молекулы в настоящее время описываются все чаще. Интересно отметить, что электрические сигналы регулируют молекулярные сигналы, которые запускают рост аксонов и образование связей. Активность играет роль в установлении паттерна связей.

Генетические подходы позволяют идентифицировать гены, которые контролируют дифференциацию целых органов, таких как глаз в целом. Геринг9) с коллегами исследовал экспрессию гена eyeless у плодовой мушки Drosophila, который контролирует развитие глаз. Удаление этого гена из генома приводит к тому, что глаза не развиваются. Гомоло-


Глава 1. Передача информации и структурная организация мозга                          33

гичные гены у мышей и человека (известные как small eye и aniridia) похожи по структуре. Если гомологичный ген eyeless млекопитающих искусственно встроен и экспрессируется у мушки, то у этого животного развиваются дополнительные (мушиные по структуре) глаза на усиках, крыльях и ногах (рис. 1.16). Это позволяет предположить, что этот ген одинаково управляет образованием глаза у мухи или мыши, несмотря на полностью различные структуру и свойства глаз насекомых и млекопитающих.

§ 5. Регенерация нервной системы после травмы

Нервная система не только устанавливает связи во время развития, но может восстанавливать некоторые связи после повреждения (ваш компьютер этого делать не может). Например, аксоны в руке могут прорастать после повреждения и устанавливать связи; рука опять может двигаться и ощущать прикосновения. Аналогично, у лягушки, рыбы или беспозвоночного животного вслед за разрушениями в нервной системе наблюдается регенерация аксонов и восстановление функции. После перерезки оптического нерва у лягушки или рыбы волокна опять прорастают и животное может видеть. Однако, эта способность не присуща центральной нервной системе взрослых позвоночных животных — у них регенерация не происходит. Молекулярные сигналы, которые блокируют регенерацию, и их

биологическое значение для функционирования нервной системы неизвестны.

Выводы

∙  Нейроны связаны друг с другом строго определенным способом.

∙  Информация от клетки к клетке передается через синапсы.

∙  В относительно простых системах, таких как сетчатка глаза, можно проследить все связи и понять значение межклеточных сигналов.

∙  Нервные клетки мозга являются материальными элементами восприятия.

∙  Сигналы в нейронах высоко стереотипны и одинаковы для всех животных.

∙  Потенциалы действия без потерь могут проходить большие расстояния.

∙  Локальные градуальные потенциалы зависят от пассивных электрических свойств нейронов и распространяются только на короткие расстояния.

∙  Особое строение нервных клеток требует специализированного механизма аксонального транспорта белков и органелл от и к телу клетки.

∙  Во время индивидуального развития нейроны мигрируют к окончательному месторасположению и устанавливают связи с мишенями.

∙  Молекулярные сигналы управляют ростом аксонов.

Цитированная литература

1.   Ramon у Cajal, S. [1909-1911] 1995. Histology of the Nervous System, 2 vols. Translated by Neely Swanson and Larry Swanson. Oxford University

Press, New York.

2.   Helmholtz, H. von. 1889. Popular Scientific Lectures. Longmans, London.

3.   Hodgkin, A. L. 1964. The Conduction of the Nervous Impulse. Liverpool University Press, Liverpool, England.

4.  Adrian,  E. D.  1946.  The Physical Background of Perception. Clarendon. Oxford, England.

5.   Katz,   B.    1966.   Nerve,   Muscle,   and   Synapse. McGraw-Hill, New York

6.   Sherrington, C. S. 1906. The fntegrative Action of the Nervous System. Reprint, Yale University Press, New Haven, CT, 1966.

7.   Kuffler, S. W. 1953. /. Neurophysiol. 16: 37-68.

8.   Hubel, D.H., and Wiesel, T.N. 1977. Proc. R.Soc. Land. В 198: 1-59.

9.   Haider, G., Callaerts, P.. and Gehring. W.J. 1995. Science 267: 1788-1792.


Раздел II. ПЕРЕДАЧА ИНФОРМАЦИИ В НЕРВНОЙ СИСТЕМЕ

Глава 2. Ионные каналы и нейрональная сигнализация

Электрические сигналы, обеспечивающие функционирование нервных клеток, опосредованы потоком ионов через водопроницаемые поры клеточной мембраны. Эти поры, образованные трансмембранными белками, называются ионными каналами. К настоящему времени разработаны высокочувствительные методы, позволяющие зарегистрировать и измерить ионные токи, протекающие через одиночные ионные каналы. В этой главе будут обсуждаться такие функциональные свойства ионных каналов, как их специфичность для того или иного иона. Кроме того, будет рассмотрена регуляция ионных каналов, приводящая к генерации необходимого типа нервного импульса.

Некоторые ионные каналы избирательно проницаемы только для катионов, тогда как другие проводят только анионы. Катионные каналы могут быть высоко избирательными по отношению к одному иону, например натрию. Ионные каналы совершают переходы между открытым и закрытым состоянием и имеют, как правило, характерное время открытого состояния. Их вклад в ионный ток через клеточную мембрану определяется относительным количеством времени, которое они находятся в открытом состоянии.

Открытие канала регулируется различными механизмами. Некоторые из этих механизмов физические, такие как растяжение мембраны или изменения мембранного потенциала. Другие механизмы химические, включающие связывание активных молекул (лигандов) с активным центром, который располагается либо с внеклеточной, либо с внутриклеточной стороны канала.

Важным свойством каналов, в дополнение к кинетике открытия и закрытия, является способность открытого канала проводить ионный ток. Один из способов, которым ионы могут проникать через открытый канал, является простая диффузия. Другой способ — взаимодействие ионов с внутриканальными центрами связывания и перескакивание внутри водной поры от одного центра к другому. В любом случае движение иона через канал является пассивным и определяется градиентом концентрации и градиентом электрического потенциала на мембране.

Количество тока, проходящего через открытый канал по электрическому градиенту, зависит от проницаемости канала для данного типа ионов. Величина тока также зависит от концентрации ионов в устьях канала. Эти два фактора, проницаемость и концентрация, определяют проводимость канала.


Глава 2. Ионные каналы и нейрональная сигнализация                                    35

В первой главе указывалось, что передача информации в нервной системе осуществляется двумя типами электрических сигналов: местными потенциалами, локализованными в специализированных участках нейрона, и потенциалами действия, которые передаются по всей протяженности нервной клетки. Эти сигналы меняют стабильный электрический потенциал клеточной мембраны, называемый мембранным потенциалом покоя. В покое, в зависимости от типа нейрона, мембранный потенциал имеет величину от -30 мВ до -100 мВ. Отрицательный знак потенциала означает, что внутриклеточный заряд мембраны отрицателен по отношению к внеклеточной среде.

Передача импульса в нервной системе опосредуется изменениями мембранного потенциала. В сенсорных нейронах адекватный стимул, такой как прикосновение, звук, свет, вызывает локальную деполяризацию (делая мембранный потенциал менее негативным) или гиперполяризацию (мембранный потенциал становится более негативным). Подобным же образом нейротрансмиттеры в синапсах вызывают деполяризацию или гиперполяризацию постсинаптической клетки. Потенциалы действия, представляющие собой короткие деполяризационные сигналы большой амплитуды, проводят по отросткам нейрона информацию из одного отдела нервной системы в другой.

Все эти изменения мембранного потенциала вызваны движением ионов через клеточную мембрану. Например, направленное внутрь клетки движение положительно заряженных ионов натрия снижает общий отрицательный заряд мембраны или, другими словами, вызывает деполяризацию. Наоборот, результатом движения положительно заряженных ионов калия из клетки является рост общего отрицательного заряда, то есть гиперполяризация. Гиперполяризация может быть обусловлена также движением внутрь клетки отрицательно заряженных ионов хлора.

Как движутся ионы через клеточную мембрану и чем их движение регулируется? Главным путем для быстрого перемещения ионов внутрь клетки и из нее являются ионные каналы. Ионные каналы представляют собой встроенные в мембрану молекулы белка, которые образуют поры, проницаемые для ионов. Ионные токи регулируются через открытие и закрытие этих ионных каналов. Знание механизмов работы ионных каналов позволяет понять, как генерируются электрические сигналы.

§ 1. Свойства ионных каналов Клеточная мембрана нервной клетки

Клеточные мембраны состоят из жидкой фазы липидов и встроенных в липиды белковых

Рис. 2.1. Клеточная мембрана   и   ионный   канал. (А) Клеточные мембраны состоят   из   жидкой   фазы   липидов   и   встроенных в липиды белковых молекул. Пронизывающие мембрану (трансмембранные) белки образуют ионные каналы. (В) Схематичное представление ионного канала с центральной водной порой и воротным механизмом (G).

Fig. 2.1. Cell Membrane and Ion Channel. (A) The cell membrane is composed of a lipid bilayer embedded with proteins. Some of the proteins traverse the lipid layer, and some of these membrane-spanning proteins form membrane channels. (B) This schematic representation shows a membrane channel in cross section, with a central water-filled pore and channel "gate" (G). The gate opens and closes irregularly; the probability of opening may be regulated by the membrane potential by the binding of a ligand to the channel or by other biophysical or biochemical conditions. A sodium ion, surrounded by a single shell of water molecules, is shown to scale in the pore for size comparison.


36                                       Раздел П. Передача информации в нервной системе

молекул. Как показано на рис. 2.1 А, молекулы липидов организованы в двухслойную мембрану (бислой) толщиной около 6 нм. Полярные гидрофильные головки липидов обращены к поверхностям мембраны, а гидрофобные хвосты вытянуты к середине бислоя. Липиды плохо пропускают воду и практически непроницаемы для ионов. Белковые молекулы частично погружены в слой липидов, либо с внеклеточной, либо с цитоплазматической стороны. Некоторые белки целиком пронизывают мембрану. Именно пронизывающие мембрану (трансмембранные) белки образуют ионные каналы. Основные ионы, участвующие в генерации электрических сигналов, такие как калий, натрий, кальций или хлор, движутся через ионные каналы пассивно благодаря градиенту концентраций и электрическому потенциалу мембраны.

Другие трансмембранные белки служат в качестве насосов и переносчиков, обеспечивающих транспорт веществ через клеточную мембрану против электрохимических градиентов. Транспортные механизмы поддерживают ионный состав цитоплазмы, удаляя или возвращая те ионы, которые прошли клеточную мембрану по их электрохимическим градиентам. Они также выполняют важную функцию переноса через клеточные мембраны субстратов метаболических реакций, таких как глюкоза и аминокислоты. Свойства транспортных молекул обсуждаются в главе 4.

Как выглядят ионные каналы?

Молекулярное строение ионных каналов и их внутримембранное устройство обсуждаются в деталях в главе 3. В контексте данной главы полезно, однако, дать несколько общих характеристик физическим свойствам ионных каналов. Трансмембранный ионный канал имеет центральную водную пору, сообщающуюся как с внеклеточным, так и с внутриклеточным пространством (рис. 2.1В). С обеих сторон канала пора расширяется, образуя устья. Узкая внутримембранная часть ионного канала формирует ворота, которые могут открываться и закрываться, регулируя прохождение ионов.

Размер белка ионного канала варьирует в значительной степени в зависимости от типа канала. Некоторые ионные каналы имеют дополнительные структуры (и связанные с ними новые свойства). На рис. 2.1В представлен типичный канал средних размеров. Для сопоставления размеров иона и ионного канала на рисунке изображен гидратированный ион натрия.

Избирательность каналов

Мембранные каналы отличаются по своей избирательности: некоторые проницаемы для катионов, другие для анионов. Некоторые катионные каналы являются селективными по отношению только к одному виду иона. Например, некоторые каналы проницаемы исключительно для ионов натрия, другие для ионов калия, прочие для ионов кальция. Однако существуют относительно неселективные катионные каналы, позволяющие проходить даже небольшим органическим катионам. Анионные каналы, связанные с передачей электрического импульса, обладают низкой специфичностью. Однако они, как правило, называются «хлорными каналами», потому что ион хлора является наиболее распространенным подвижным анионом в биологических жидкостях. Вдобавок, некоторые каналы (называемые коннексонами) соединяют соседние клетки и проницаемы как для многих неорганических ионов, так и для некоторых мелких органических молекул. Коннексоны обсуждаются в главе 7.

Открытое и закрытое состояния

Хотя для простоты мы часто представляем белковые молекулы как статические структуры, они таковыми вовсе не являются. Из-за своей тепловой энергии все большие молекулы внутренне нестабильны. При комнатной температуре химические связи растягиваются и ослабляются, то есть постоянно колеблются по отношению к устойчивому состоянию. Несмотря на то, что эти индивидуальные движения составляют величину только около 10–12 м (с частотой, достигающей 1013 Гц), такие атомные колебания могут приводить в итоге к гораздо более значительным и более медленным изменениям в структуре молекул. Это происходит потому, что многочисленные быстрые движения атомов периодически создают условия для взаимодействия функциональных групп белка, несмотря на наличие взаимных отталкивающих сил. Взаимодействия функциональных групп приводят к кинетическим переходам белка, которые, раз возникнув, могут длиться многие миллисекунды или даже секунды. Известным примером может служить молекула гемоглобина. Центры связывания кислорода заключены внутри макромолекулы этого белка,


Глава 2. Ионные каналы и нейрональная сигнализация                                    37

и к ним нет постоянного свободного доступа. Связывание кислорода может быть достигнуто только за счет транзиторного доступа молекул газа к центрам связывания на молекуле тема. Таким образом, молекула гемоглобина «дышит», периодически становясь доступной для связывания кислорода, иначе данный белок был бы не способен выполнять предназначенную функцию по переносу газов 1).

Для ионных каналов функционально важными являются переходы между открытым и закрытым состояниями. Эти переходы совершаются практически моментально. С другой стороны, при системном изучении поведения любого ионного канала мы обнаружим, что время открытого состояния варьирует случайным образом. Иногда канал открыт только одну миллисекунду или даже меньше, хотя в следующий раз он может быть открыт на гораздо более продолжительное время (рис. 2.4). Тем не менее, каждый канал имеет характерное среднее время открытого состояния (т), и все вариации происходят вокруг этого среднего показателя.

Некоторые ионные каналы открываются достаточно часто даже в покое. Иными словами, вероятность нахождения таких каналов в открытом состоянии в неактивированной клетке относительно высока. Большинство таких ионных каналов проницаемо для калия или хлора. Они важны для генерации мембранного потенциала покоя. Остальные ионные каналы при этом закрыты, то есть вероятность нахождения их в открытом состоянии очень низка. Активация этих каналов адекватным стимулом резко увеличивает вероятность открытия. Этот же стимул может деактивировать ионные каналы, бывшие активными в покое. Важно помнить, что активация или деактивация канала означает возрастание или снижение вероятности открытия канала, но не увеличение или уменьшение времени открытого состояния (т) канала.

Помимо активации и деактивации, ионный ток через каналы регулируется двумя другими факторами. Первый фактор заключается в том, что ионный канал переходит в новое конформационное состояние, в котором обычный активирующий стимул не способен вызвать открытие канала. Для ионных каналов, активируемых деполяризацией, такое состояние называется инактивацией. Для каналов, отвечающих на химические стимулы, это состояние известно как десенситнзация. Второй механизм — блок открытого канала. Такое случается, когда, например, крупная молекула (такая как токсин) связывается с ионным каналом и физически закупоривает пору. Другим примером может служить блокирование некоторых катионных каналов ионами магния. В этом случае ионы магния сами не проникают через ионный канал, но связываются с каналом в области его устья и тем самым мешают проникновению других катионов.

Способы активации

Рис. 2.2 суммирует представления о способах активации ионных каналов. Некоторые каналы специфически отвечают на физические изменения в клеточной мембране нейрона. Наиболее яркими представителями этой группы являются потенциал-активируемые каналы. Примером может служить чувствительный к потенциалу натриевый канал, который отвечает за регенеративную деполяризацию, лежащую в основе генерации потенциала действия (глава 6). К этой группе относятся также механочувствительные ионные каналы, которые отвечают на механическое воздействие на клеточную мембрану. Рецепторы растяжения, содержащие ионные каналы такого рода, найдены в механорецепторах кожи (глава 17).

Другие ионные каналы открываются тогда, когда химические агенты активируют связывающие центры на молекуле канала. Такие лнганд-актнвнруемые ионные каналы подразделяются на две подгруппы, в зависимости от того, являются ли активные центры внутриклеточными или внеклеточными. Каналом, отвечающим на внеклеточную активацию, является катионный канал постсинаптической мембраны в скелетной мышце. Этот канал активируется нейротрансмиттером ацетилхолином, освобождающимся из двигательного нервного окончания (глава 9). Открытие ацетилхолин-активируемого ионного канала позволяет ионам натрия войти в клетку, вызывая деполяризацию мышечного волокна.

Лиганд-активируемые каналы, отвечающие на внутриклеточные стимулы, включают каналы, чувствительные к местным изменениям концентрации специфических ионов. Например, кальций-активируемые калиевые каналы активируются локальным повышением концентрации внутриклеточного кальция. Такие каналы играют важную роль в реполяризации клеточной мембраны во время завершения потенциала действия. Помимо ионов кальция, типичными представителями лигандов, активирующих ионные каналы с ци-


38                                       Раздел П. Передача информации в нервной системе

Рис. 2.2. Способы   активации   ионных   каналов. (А)  Ионные каналы, активируемые   изменением мембранного   потенциала или растяжением мембраны. (В) Ионные каналы, активируемые химическими агентами, либо с внеклеточной, либо с внутриклеточной стороны.

Fig. 2.2. Modes of Channel Activation. The probability of channel opening is influenced by a variety of stimuli. (A) Some channels respond to changes in the physical state of the membrane, specifically changes in membrane potential (voltage-activated) and mechanical distortion (stretch-activated). (B) Ligand activated channels respond to chemical agonists, which attach to binding sites on the channel protein. Neurotransmitters, such as glycine and acetylcholine, act on extracellular binding sites. Included among a wide variety of intracellular ligands are calcium ions, subunits of G proteins, and cyclic nucleotides.

топлазматической стороны мембраны, являются циклические нуклеотиды. Циклический ГМФ, например, отвечает за активацию натриевых каналов в палочках сетчатки. Такой тип канала играет принципиальную роль в работе зрительного анализатора (глава 19).

Эта классификация не является достаточно строгой. Например, кальций-активируемые калиевые каналы чувствительны также к изменению потенциала, а некоторые потенциал-активируемые ионные каналы чувствительны к внутриклеточным лигандам.

§ 2. Измерение токов одиночного канала

Пэтч-кламп метод

Для измерения ионных токов через одиночные каналы первоначально был предложен непрямой метод анализа мембранного шума 2· 3). Затем был разработан способ прямой регистрации одиночных ионных каналов с помощью метода, который называется пэтч-кламп (patch-clamp 4· 5)). В совокупности эти подходы дали прямые ответы на вопросы, касающиеся функции ионных каналов, как то: какой заряд проходит через одиночный канал? как долго канал остается открытым? как время нахождения ионного канала в открытом или закрытом состоянии зависит от мембранного потенциала?

Пэтч-кламп метод, предложенный Э. Неером, Б. Сакманном и их коллегами, значительно углубил наши знания о функционировании ионных каналов. Для пэтч-кламп регистрации необходимо, чтобы кончик стеклянной пипетки с внутренним диаметром около 1 мкм плотно контактировал с мембраной исследуемой клетки. При удачном подведении, благодаря легкому присасыванию, между клеточной мембраной и стеклом пипетки (рис. 2.3А—В) создается сопротивление больше 109 Ом (отсюда возник термин «гигаомный контакт», gigaohm seal). Когда пипетка соединена с соответствующим усилителем, можно зарегистрировать небольшие токи, проходя-щие через участок мембраны, находящейся внутри кончика пипетки (рис. 2.3F). Такая конфигурация пэтч-кламп метода называется cell attached (контакт с клеткой). Высокоомный контакт гарантирует, что ионные токи, проводимые этим участком клеточной мембраны, проходят преимущественно через


Глава 2. Ионные каналы υ нейрональная сигнализация                                    39

Рис. 2.3. Регистрация ионных токов методом пэтч-кламп. Электрод образует плотный контакт с мембраной (А), который благодаря легкому понижению давления превращается в гигаомный контакт (В). Оттягивание мембраны с последующим отрывом ее фрагмента приводит к конфигурации inside-out (С). Другой вариант основан на последовательном образовании конфигурации whole cell, и затем — outside-out (E).

Fig. 2.3. Patch Clamp Recording. (A-E) Patch configurations, represented schematically. The electrode forms a seal on contact with the cell membrane (A), which is converted to a gi-gaohm seal by gentle suction (B)   Records may then be made from the patch of membrane within the electrode tip (cell-attached patch). Pulling away from the cell results in the formation of a cell-free vesicle, whose outer membrane can then be ruptured to form an inside-out patch (C). Alternatively, the membrane within the electrode tip may be ruptured by further suction to obtain a whole-cell recording (D) or, by pulling, to obtain an outside-out patch (E). (F) Recording arrangement. The patch electrode is connected to an amplifier that converts channel currents to voltage signals. The signals are then displayed on an oscilloscope trace or computer screen so that amplitudes and durations of single-channel currents can be measured. (A-E after Hamill et al., 1981.)

усилительную аппаратуру, а не теряются в месте контакта пэтч-пипетки с клеткой. При использовании пэтч-кламп метода регистрируемые события состоят из прямоугольных токовых сигналов, отражающих процессы открытия и закрытия одиночных ионных каналов. Таким образом, мы в реальном времени можем наблюдать активность одиночных белковых молекул мембраны.

В простом случае токи одиночных каналов появляются нерегулярно и с различной продолжительностью, но с постоянной амплитудой (рис. 2.4А). В некоторых случаях, однако, картина токов может быть более сложной. Некоторые ионные каналы, например, в открытом состоянии могут иметь более чем один уровень проводимости, как это показано на рис. 2.4В. Кроме того, ионные каналы могут проявлять комплексную кинетику. Например, ток через одиночный ионный канал может выглядеть не как простой прямоугольник, а как «вспышка» открытий канала (рис.2.4С).

Таким образом, пэтч-кламп метод предоставляет новые уникальные возможности для изучения поведения ионных каналов. Во-первых, изоляция маленького участка мембраны позволяет наблюдать активность всего нескольких ионных каналов, а не тысяч, которые активируются в целой клетке. Во-вторых, высокое сопротивление контакта дает возможность регистрировать даже крайне


40                                       Раздел П. Передача информации в нервной системе

Рис. 2.4. Примеры одиночных ионных каналов, зарегистрированных методом пэтч-кламл.

Fig. 2.4. Examples of Patch Clamp Recordings. (A) Glutamate-activated channel currents recorded in a cell-attached patch from locust muscle occur irregularly, with a single amplitude and varied open times. Downward deflections indicate current flowing into the cell. (B) Acetylcholine-activated currents from single channels in an outside-out patch from cultured embryonic rat muscle reach a maximum amplitude of about 3 pA and relax to a substate current of about 1,5 pA. Downward deflections indicate inward current. (C) Pulses of outward current through glycine activated chloride channels in an outside-out patch from cultured chick spinal cord cells are interrupted by fast closing and reopening transitions to produce bursts. (A after Cull-Candy, Miledi, and Parker, 1980; В after Hamill and Sakmann, 1981; С from A. I. McNiven and A. R. Martin, unpublished.)

малые токи. В результате мы имеем возможность точного измерения амплитуд токов одиночных ионных каналов и можем провести анализ кинетики каналов.

Конфигурации пэтч-кламп метода

Пэтч-кламп метод позволяет осуществлять также регистрацию ионных каналов и в других конфигурациях. Достигнув контакта в конфигурации cell attached, можно, отводя электрод, оттянуть участок мембраны для формирования inside-out (внутренняя сторона наружу) конфигурации (рис. 2.3С). В последнем случае цитоплазматическая сторона мембраны будет обрашена к перфузионному раствору. С другой стороны, с помощью небольшого дополнительного присасывания можно прорвать участок мембраны, расположенный внутри регистрирующего электрода, обеспечив контакт последнего с цитоплазмой клетки (рис. 2.3D). В этих условиях будут регистрироваться токи в конфигурации whole-cell (целая клетка). Наконец, после получения конфигурации «целая клетка», можно оттянуть электрод от клетки, сформировав из мембраны сначала тонкую перемычку, а затем, после отделения этого участка, получить конфигурацию outside-out (наружная сторона наружу; рис. 2.3Е). Каждая из этих конфигураций имеет свои преимущества, их использование зависит от типа изучаемого ионного канала и той информации, которую мы хотим получить в данном эксперименте. Например, для аппликации веществ на внешнюю сторону мембраны предпочтительной является конфигурация outside-out.

Пэтч-кламп конфигурация «целая клетка» предполагает обмен между цитоплазмой


Глава 2. Ионные каналы и нейрональная сигнализация                                    41

клетки и раствором, заполняющим регистрирующую пипетку. Этот обмен, называемый иногда «диализ», может быть использован для намеренной замены внутриклеточного состава ионов на те, которые находятся в пипетке. С другой стороны (особенно в тех случаях, когда клетка мала), необходимо учитывать, что важные цитоплазматические компоненты могут быть потеряны из-за их быстрого перехода во внутрипипеточный раствор. Такой потери можно избежать, используя так называемый перфорированный пэтч-кламп метод 6). В этом случае для формирования начальной cell attached конфигурации используется пипетка, заполненная веществом, способным формировать мембранные поры (например антибиотик нистатин). По прошествии некоторого времени в изолированном с помощью электрода участке мембраны образуются проницаемые для электролитов поры, позволяющие регистрировать ионные токи в конфигурации «целая клетка».

Внутриклеточная микроэлектродная регистрация

До разработки пэтч-кламп метода свойства ионных каналов в клеточных мембранах исследовались в экспериментах, в которых для измерения мембранного потенциала или мембранного тока использовались стеклянные микроэлектроды. Использование Лингом и Джерардом 7) в 1949 году стеклянных микроэлектродов для внутриклеточной регистрации ионных токов в живых клетках было не менее важным событием, чем введение пэтч-кламп метода три десятилетия спустя. Этот метод обеспечивал точное измерение мембранного потенциала покоя клетки, потенциала действия, а также ответов на синаптическую активацию мышечных волокон и нейронов (глава 1).

Метод внутриклеточной регистрации проиллюстрирован на рис. 2.5А. Острая стеклянная микропипетка, диаметр кончика которой не превышает 0,5 мкм, заполненная концентрированным солевым раствором (например, 3 M KC1), служит электродом и присоединяется к вольтметру для записи потенциала. Момент прокалывания пипеткой клеточной мембраны, приводящий к проникновению ее в клеточную цитоплазму, проявляется мгновенным появлением потенциала, соответствующего мембранному потенциалу покоя. При удачном проникновении в клетку мембрана обхватывает внешнюю поверхность пипетки, благодаря чему цитоплазма остается изолированной от внеклеточной жидкости.

Внутриклеточная регистрация шума ионных каналов

В начале 1970-х годов, используя нервно-мышечный синапс лягушки, Катц и Миледи предприняли оригинальные эксперименты, в которых метод внутриклеточной микроэлектродной регистрации использовался для изучения характеристик «шумов», продуцируемых медиатором ацетилхолином (АХ). В таком синапсе АХ, освобождаюшийся из моторного нервного окончания, открывает хемовозбудимые ионные каналы постсинаптической мембраны. Вход катионов в волокно через открытые ионные каналы вызывает деполяризацию мембраны (глава 9). Когда Катц и Миледи локально апплицировали экзогенный АХ на область синапса, они обнаружили, что вызванная деполяризация сопровождалась электрическим «шумом». Во время стабильной деполяризации быстрые колебания потенциала были гораздо больше колебаний изолинии в покое. Они предположили, что возрастание электрического шума в присутствии АХ было связано с хаотичным открытием и закрытием АХ-активируемых ионных каналов. Иными словами, аппликация АХ приводила к открытию большого числа ионных каналов, и число это случайно колебалось в зависимости от числа взаимодействий АХ с рецепторами.

Используя известную из физики технику анализа шума, Катц и Миледи смогли получить информацию о среднестатистическом поведении отдельного ионного канала, активируемого АХ. Позднее подобные эксперименты были проведены на том же объекте Anderson и Stevens 3). В отличие от предшественников, эти исследователи измеряли мембранный ток, вызванный АХ, что позволило установить величину и продолжительность ионных токов через одиночный канал (рис. 2.5В).

Принципы анализа шума достаточно просты: во-первых, если токи одиночного канала являются большими, суммарный шум также будет большим. Во-вторых, ионные каналы, открывающиеся на относительно длительное время, будут продуцировать низкочастотный шум; наоборот, каналы, открывающиеся на короткое время, будут продуцировать высокочастотный шум. Исследование амплитудно-временных характеристик шумов, ак-


42                                       Раздел II. Передача информации в нервной системе

Рис. 2.5. Внутриклеточное отведение электрического «шума», производимого функционированием ионных каналов. (А) Схема установки для регистрации мембранного потенциала. (В) Внутриклеточная регистрация эффекта ацетилхолина. (С) При большем усилении виден ацетилхолиновый «шум».

Fig. 2.5.   Intracel ular   Recording   of  Channel Noise. (A) Arrangement for recording membrane potentials of muscle fibers with a microelectrode. The electrode is connected to a preamplifier, and the signals are displayed on an oscilloscope or computer screen. Penetration of the electrode into a fiber is marked by the sudden appearance of the resting potential (downward deflection on the screen). After penetration, changes in potential due to channel activation can be measured. (B) Intracellular records of the effect of acetylcholine (ACh). In this experiment additional circuitry was used to record membrane current (rather than membrane potential). At rest (upper trace), there is no current across the membrane; application of ACh produces about 130 nA of inward current (lower trace). (C) Traces in В shown at greater amplification. The baseline shows little fluctuation at rest; the inward current produced by ACh shows relatively large fluctuations ("noise"), due to random opening and closing of ACh-activated channels. Analysis of the increased noise yields values for the single-channel current and the mean open time of the channels. (B and С after Anderson and Stevens, 1973.)

тивированных АХ в нервно-мышечном синапсе, показало, что через одиночный открытый ионный канал проходит около 10 миллионов ионов в секунду. Кроме того, выяснилось, что значение среднего открытого времени () ионного канала составляет от 1 до 2 мс.

Несмотря на широкое вытеснение пэтч-кламп методом, анализ шума до сих пор используется для изучения ионных каналов в клетках, которые не поддаются исследованию с помощью пэтч-клампа, например, в некоторых областях центральной нервной системы 8). Кроме того, анализ шума является сравнительно быстрым методом для получения информации о свойствах большой популяции каналов и используется в комбинации с пэтч-кламп регистрацией от целой клетки для идентификации типов каналов. Тем не менее, надо понимать, что с помощью анализа шума невозможно получить детальную информацию о поведении одиночного канала, особенно в каналах со сложной кинетикой или при наличии нескольких уровней проводимости канала.

Проводимость каналов

Кинетическое поведение канала, то есть время его нахождения в закрытом и открытом состояниях, может предоставить информацию о механизмах открытия и закрытия канала, а также о константах скоростей этих процессов. С другой стороны, величина тока, проходящего через ионный канал, является прямым отражением того, как быстро проникающие ионы движутся через канал. Ток ионов зависит не только от свойств канала, но также от трансмембранного потенциала. Пример такого рода показан на рис. 2.6. На этом рисунке изображен фрагмент мембраны, который содержит один спонтанно активный ионный канал, проницаемый для калия. Растворы, как в пипетке, так и в ванночке для объекта, содержат одинаковую (150 ммоль) концентрацию ионов калия. Ионы калия через открытый канал могут двигаться в обоих направлениях. Однако поскольку концентрации ионов по обе стороны мембраны идентичны, а трансмембранный потенциал отсутствует, то нет никакого движения ионов ни в одном


Глава 2. Ионные каналы и нейранальная сигнализация                                    43

Рис. 2.6. Влияние потенциала на ток через   одиночный   калиевый   канал в симметричном растворе ионов калия по обе стороны мембраны. (А) Схема установки. (B-D) Примеры токов через одиночные ионные каналы при разных уровнях мембранного потенциала. (Е) Ток через калиевый канал как функция мембранного потенциала.

Fig. 2.6. Effect of Potential on Currents through a single, spontaneously active potassium channel in an outside-out patch, with 150 mM potassium in both the electrode and the bathing solution. (A) The recording system. The output from the patch clamp amplifier is proportional to the current across the patch. The potential across the patch is equal to the potential (VC) applied to the input of the amplifier as shown. Positive charge flowing out of the electrode is defined as positive current. (B) When no potential is applied to the patch, no channel currents are seen because there is no net flux of potassium through the channels. (C) Application of +20 mV to the electrode results in an outward current (upward deflections) of about 2 pA through the channels. (D) A -20 mV potential results in inward channel currents (downward deflections) of the same amplitude as in С. (Е) Channel currents as a function of applied voltage. The slope of the line is the channel conductance (7). In this case, 7 = 110 pS (picosiemens).

из направлений. Поэтому на данном рис. 2.6В показано отсутствие мембранного тока.

Пэтч-кламп метод имеет достоинство, которое еще не было упомянуто: мы можем менять потенциал на регистрирующей пипетке и варьировать, таким образом, трансмембранную разность потенциалов. Например, при мембранном потенциале +20 Мв каждое открытие калиевого ионного канала сопровождается током, направленным наружу (рис. 2.6С). Это связано с тем, что положительно заряженные ионы калия двигаются через канал по электрическому градиенту между раствором в пипетке и в ванночке. С другой стороны, когда внутри пипетки создан отрицательный потенциал величиной в -20 мВ


44                                       Раздел II. Передача информации в нервной системе

(рис. 2.6D), ток направлен в обратном направлении (через открытый канал в пипетку).

Зависимость тока от величины потенциала на мембране представлена на рис. 2.6Е. Эта зависимость является линейной: ток (I), проходящий через канал, пропорционален потенциалу (V):

Это формула представляет собой преобразованный закон Ома (приложение А). Константа 7 называется проводимостью канала. При одном и том же потенциале на мембране канал с высокой проводимостью переносит много тока, канал с низкой проводимостью проводит малый ток.

Проводимость измеряется в сименсах (См). В нейронах трансмембранный потенциал обычно выражается в милливольтах (1 мВ = 10–3 В), токи одиночных ионных каналов в пикоамперах ( 1 пА = 10–12 А), проводимость в пикосименсах (1 пСм = 10–12 См). На рис. 2.6 потенциал +20 мВ продуцировал ток около 2,2 пА, соответственно проводимость канала ( = I/V) составила 2,2 пА/20 мВ = 110 пСм.

Проводимость и проницаемость

Проводимость ионного канала  зависит от двух факторов: во-первых, от той легкости, с которой ионы проходят через открытый канал. Это внутреннее свойство канала известно как проницаемость канала. Во-вторых, проводимость зависит от концентрации ионов около устьев канала. Ясно, что если ионы калия отсутствуют как внутри, так и снаружи клетки, то не может быть и тока. При этом становится не важно, какова проницаемость канала или насколько велик мембранный потенциал. Если присутствует всего несколько ионов калия, то, при одной и той же величине проницаемости и стандартном трансмембранном потенциале, ток через ионный канал будет гораздо меньше, чем при избыточной концентрации ионов калия. Эти взаимоотношения могут быть представлены следующим образом:

Открытый канал  —> проницаемость

Проницаемость + ионы —> проводимость.

Равновесный потенциал

В уже рассмотренных примерах ионного тока концентрации ионов калия были одинаковыми по обе стороны мембраны. Что произойдет, если мы сделаем концентрации этого иона в пипетке и в ванночке различными? Представим, что после получения конфигурации outside-out, как это показано на рис. 2.7 А, концентрация калия в ванночке составляет 3 ммоль (подобно нормальной внеклеточной концентрации этого иона), а внутри электрода эта концентрация равняется 90 ммоль (подобно цитоплазматической концентрации). Если калиевый канал в мембране будет открыт, то ионы калия начнут двигаться из пипетки в ванночку. Такой ток будет происходить даже при отсутствии потенциала на пипетке (рис. 2.7В), так как движущей силой для ионов калия является градиент концентраций. Если же мы зарядим пипетку положительно, градиент потенциала на мембране будет еще более увеличивать движение положительно заряженных ионов калия наружу (к минусу). В результате ток ионов через калиевые каналы будет возрастать (рис. 2.7 С). И наоборот, если придать пипетке отрицательный заряд, движение ионов калия из электрода наружу через мембрану замедлится и канальный ток уменьшится (рис. 2.7 D). Важно отметить, что при достаточно большом отрицательном заряде ионы калия начнут движение внутрь, то есть против градиента концентрации (рис. 2.7Е). Зависимость ионного тока от напряжения на мембране для этой экспериментальной модели показана на рис. 2.7 F.

Рис. 2.7 F иллюстрирует, что ток ионов калия через канал зависит от электрического потенциала мембраны и градиента концентрации калия. Сочетание этих двух факторов формирует электрохимический градиент для калия. В отличие от начального результата, полученного при одинаковых концентрациях ионов калия по обе стороны мембраны (рис. 2.6), в данном примере ионный ток равен нулю при потенциале на пипетке -85 мВ. При этом потенциале стремление ионов калия выйти через канал наружу по градиенту концентраций полностью уравновешено трансмембранной разницей электрического потенциала, которая направляет движение ионов в противоположном направлении. Этот трансмембранный потенциал называется калиевым равновесным потенциалом K) Равновесный потенциал зависит только от концентрации ионов по обе стороны мембраны, но не от свойств ионного канала или механизма проникновения ионов через канал.


Глава 2. Ионные каналы и нейрональная сигнализация                                    45

Рис. 2.7. Потенциал реверсии для калиевого тока в асимметричном растворе калия. Остальные обозначения такие же, как на рис. 2.6.

Fig. 2.7. Reversal  Potential For  Potassium Currents in a hypothetical experiment using an outside-out patch with the concentration of potassium in the recording pipette ("in-tracellular" concentration) 90 mM and in the bathing solution ("extracellular" concentration) 3 mW. (A) Recording arrangement as in Figure 2.6. (B) With no potential applied to the pipette, the flux of potassium from the electrode to the bath along its concentration gradient produces outward channel currents. (C) When a potential of +20 mV is applied to the pipette, outward currents increase in amplitude. (D) Application of -50 mV to the pipette reduces outward currents. (E) At -100 mV, currents are reversed. (F) The current-voltage relation indicates zero current at —85 mV, which is the potassium equilibrium potential (EK).

Уравнение Нернста

Какой именно потенциал необходим для того, чтобы уравновесить эффект реальной разницы концентраций ионов калия? Предположение о том, что Ек просто пропорционален разнице между внутриклеточной [К]i и внешней [К]0 концентрацией ионов калия, не совсем верно. Точнее, равновесный потенциал зависит от разницы между логарифмами концентраций:

Константа k определяется из формулы RT/(zF), где Rгазовая постоянная, Т — абсолютная температура, z  — валентность иона (в данном случае +1 ) и F — число Фарадея

(число кулонов электричества в 1 молярном растворе иона). Таким образом,

что можно представить как:

Это уравнение называется уравнением Нернста для ионов калия. Аналогично, можно построить уравнение Нернста и для других основных ионов. Отношение RT/(zF) измеряется в вольтах и равно примерно 25 мВ при температуре 20° С. Иногда более удобно пользоваться десятичным (log), а не натуральным логарифмом (ln). Тогда значение


46                                      Раздел II. Передача информации в нервной системе

RT/(zF) должно быть умножено на In 10, или 2,31, что даст в результате 58 мВ. То есть:

При температуре тела млекопитающих (37° С) вместо 58 мВ следует использовать 61 мВ. Для клетки, показанной на рис. 2.7, значение £?к = —85 мВ соответствует отношению концентраций 1/30.

Необходимо отметить, что диффузия иона по градиенту концентрации не строго зависит от его концентрации. Во всех растворах, кроме очень слабых, ионы взаимодействуют друг с другом, что проявляется в электростатическом притяжении или отталкивании заряженных частиц. Результатом таких взаимодействий является снижение эффективной концентрации ионов. Эффективная концентрация иона называется активностью. Поэтому более точным теоретическим параметром для уравнения Нернста является соотношение активностей, а не соотношение концентраций. Однако поскольку суммарные концентрации ионов внутри и вне клетки близки (глава 5), соотношение активности ионов не будет существенно отличаться от соотношения концентраций.

Движущая сила

Рис. 2.7F иллюстрирует важный момент для прохождения тока через ионные каналы: без приложения потенциала ток составляет около 4 рА, тогда как с потенциалом на пипетке -85 мВ ионный ток равен нулю. Следовательно, ионный ток определяется не абсолютным значением мембранного потенциала (Vm), a разницей между мембранным потенциалом и равновесным потенциалом для данного иона, в данном случае для иона калия к). Эта разница VmЕк является движущей силой для прохождения ионов через канал. Вновь обратимся к рис. 2.7F: при мембранном потенциале, равном нулю, движущая сила составляет +85 мВ.

Нелинейные отношения «ток—напряжение»

Вторым характерным свойством зависимости «ток—напряжение» на рис. 2.7F, в отличие от рис. 2.6Е, является ее нелинейность. При сдвиге от равновесного потенциала -85 м В

в сторону деполяризации (то есть к нулю) ток меняется более быстро, чем при переходе в сторону гиперполяризации. Это происходит из-за того, что проводимость канала является функцией концентрации иона. В нашем примере концентрация ионов калия внутри пипетки гораздо выше концентрации этого иона во внешнем растворе. Это приводит к тому, что током, идущим наружу, переносится больше ионов, чем током, направленным внутрь. По мере сдвига от равновесного потенциала в сторону деполяризации, этот эффект становится все более заметным. Поэтому зависимость «ток—напряжение» имеет направленный вверх изгиб, несмотря на то, что проницаемость этого типа канала практически не зависит от потенциала.

Нелинейные отношения «ток—напряжение» наблюдаются также в ионных каналах, обладающих выпрямляющими свойствами. В таких каналах проницаемость зависит от потенциала, поэтому при определенном потенциале ионы двигаются в одном направлении гораздо легче, чем в обратном. Одним из таких примеров является потенциалзависимый калиевый канал, называемый каналом внутреннего выпрямления (inward rectifier). Такой тип канала позволяет ионам калия двигаться внутрь клетки при потенциале, более негативном, чем равновесный калиевый потенциал. Однако при потенциалах, менее негативных по отношению к равновесному калиевому потенциалу, выходящий ток или очень мал, или полностью отсутствует.

Проницаемость ионных каналов

Каким же образом ионы проходят через каналы? Одним из возможных механизмов является диффузия через водную среду, заполняющую пору. Представление о диффузии лежало в основе ранних гипотез о процессе ионной проницаемости. Однако для большинства каналов простая диффузия описывает ионную проницаемость недостаточно адекватно. Главная причина в том, что проникающие ионы вступают во взаимодействие с белками ионного канала. Так, в растворе, благодаря наличию заряда, ионы всегда покрыты гидратной оболочкой (рис. 2.1). В случае катионов молекулы воды ориентированы таким образом, что отрицательно заряженный кислород


Глава 2. Ионные каналы и нейрональная сигнализация                                    47

обращен в сторону иона. Если пора ионного канала достаточно узкая, необходимо некоторое количество энергии, чтобы освободить ион от ассоциированных молекул воды и позволить ему проникнуть через этот участок (глава 3). В канале ион может быть объектом притяжения или отталкивания электростатическими зарядами стенки канала. Взаимодействие иона с комплементарными центрами ионного канала может приводить к тому, что процесс проникновения будет представлять собой своеобразный «перескок» иона с одного центра связывания на другой. Такие взаимодействия иона со стенкой канала могут влиять как на ионную избирательность, так и на скорость потока ионов. Модели, описывающие ионную проницаемость по этому механизму, называются моделями Эйринга 9). В целом, такие модели описывают ионную избирательность и проводимость гораздо более адекватно, чем модели простой диффузии.

Значение ионных каналов

Функционирование ионных каналов, описанных в этой главе, дает возможность нейронам реагировать на сигналы из внешней среды или от других нейронов, передавать импульсы на большие расстояния к исполнительным органам или к другим нейронам. Таким образом, вся сложная система восприятия и анализа сигналов, так же как генерация двигательной команды, определяется, в конечном счете, активностью ионных каналов.

Важно понимать, что все ионные токи, лежащие в основе нейрональной сигнализации, обусловлены пассивным движением ионов через открытые ионные каналы по градиенту концентрации и в зависимости от заряда клеточной мембраны. Другими словами, нейроны используют электрохимические градиенты для генерации потока ионов и, как следствие, для формирования электрических сигналов. Потенциально ионные токи могли бы нарушать эти градиенты, однако в действительности этого не происходит, так как клетки используют энергию, образуемую в ходе метаболизма, для поддержания ионного состава цитоплазмы. Специализированные механизмы, лежащие в основе активного транспорта ионов, описаны в главе 4.

Выводы

∙  Электрические сигналы в нервной системе генерируются движением ионов через мембрану нервной клетки. Эти ионные токи протекают через водные поры трансмембранных белков, известных как ионные каналы.

∙  Каналы различаются  по  своей  избирательности: некоторые катионные каналы пропускают только  натрий,  калий  или кальций, другие являются менее избирательными. Анионные каналы сравнительно не избирательны для малых анионов, но они пропускают в основном ионы хлора, так как хлор является самым распространенным анионом внеклеточной и внутриклеточной жидкостей.

∙  Каналы совершают переходы между открытым и закрытым состояниями. Каждый канал имеет присущее ему время открытого состояния. Когда каналы активированы, вероятность их открытия возрастает. Деактивация снижает частоту открытия. Каналы также могут быть инактивированы или блокированы.

∙  Каналы  могут быть  классифицированы по типу их активации: механочувствительные, потенциал-активируемые, лиганд-активируемые.

∙  Ионы движутся через каналы пассивно в соответствии с градиентом концентрации или электрическим градиентом на мембране.

∙  Результирующий поток ионов через канал по градиенту концентрации может быть снижен   противоположно  направленным электрическим  градиентом.  Электрический потенциал, снижающий результирующий поток какого-либо иона до нуля, называется равновесным потенциалом данного иона. Отношение между равновесным потенциалом и градиентом концентрации описывается уравнением Нернста.

∙  Движущая сила для движения ионов через мембрану есть разница между равновесным и мембранным потенциалами. Ионный ток, протекающий через одиночный канал, зависит от движущей силы для данного иона и проводимости канала для этого иона. В свою очередь, проводимость зависит от проницаемости данного канала и внешней и внутренней концентраций ионов.


48                                   Раздел II. Передача информации в нервной системе

Рекомендуемая литература

о Hille, В. 1992. Ion Channels in Excitable Membranes, 2nd Ed. Sinauer, Sunderland, MA, pp. 291-314.

о Pun, R. Y. K., and Lecar, H. 1998. Patch clamp techniques and analysus. In N. Sperelakis (éd.), Cell

Physiology Source Book, 2nd Ed. Academic Press, San Diego, CA, pp. 391-405.

Цитированная литература

1.   Karplus, M., and Petsko, G. A. 1990. Nature 347: 631-639.

2.   Katz, В., and Miledi, R.  1972. J. Pliysiol. 224: 665-699.

3.  Anderson, C. R., and Stevens, C. F. 1973. /. Pliysiol. 235: 665-691.

4.   Neher, E., Sakmann, В., and Sieinbach, J. H. 1978. Pflugers Arch. 375: 219-228.

5.   Hamill, O. P., et al. 1981. Pflugers Arch. 391:85-100.

6.   Horn, R., and Marty, A. 1988. J. Gen. Pliysiot. 92: 145-149.

7.   Ling, G., and Gerard, R.W. 1949. J. Cell Сотр. Physiol. 34: 383-396.

8.  Gold, M. R., and Martin, A. R. 1983. /. Physiol. 342:99-117.

9.  Johnson, F. H., Eyring, H., and Polissar, M. J. 1954. Tlie Kinetic Basis of Molecular Biology. Wiley, New York.


Глава 3. Структура ионных каналов

Молекулярная структура ионных каналов может быть расшифрована и соотнесена с их функцией с помощью различных экспериментальных методов. Эти методы включают: биохимическое выделение белков, клонирование, определение последовательности аминокислот, точечные мутации для изменения аминокислотной последовательности в отдельных участках молекулы белка, экспрессию ионных каналов в чужеродных клетках, таких, например, как ооциты лягушек ксенопус (Xenopus). Кроме того, физическое устройство каналов может быть изучено посредством электронной микроскопии, электронной и рентгеновской дифракции.

Наиболее широко комбинация этих экспериментальных подходов была использована для изучения лиганд-активируемых каналов ацетилхолинового рецептора. Этот рецептор состоит из пяти отдельных субъединиц, собранных кольцом вокруг центра. Две из них — -субъединицы — содержат рецепторы для медиатора ацетилхолина. Каждая субъединица имеет четыре трансмембранных домена (обозначаемых как M1, М2, МЗ и М4), соединенных с помощью внутри-и внеклеточных фрагментов белковой молекулы. М2 домены всех пяти субъединиц формируют проницаемую для ионов пору ионного канала. Ацетилхолиновый рецептор является представителем суперсемейства лиганд-активируемых рецепторов, включающего также рецепторы для глицина, -аминомасляной кислоты (ГАМК) и серотонина.

Потенциал-активируемые каналы образуют другое суперсемейство ионных каналов. Установлено, что потенциал-активируемый натриевый канал является единой большой молекулой с четырьмя повторяющимися доменами, расположенными кольцом вокруг центра. Каждый домен содержит шесть трансмембранных сегментов (обозначаемых как S1-S6). В каждом из четырех доменов фрагмент белка между сегментами S5 и S6 обращен к центру и формирует проницаемую для ионов пору. Потенциал-активируемые кальциевые каналы имеют сходную структуру. Потенциал-активируемые калиевые каналы также подобны по конфигурации натриевым или кальциевым каналам, но с одним важным отличием: они состоят не из одной молекулы, а из 4 отдельных субъединиц.

Аминокислотные последовательности и детальная информация о структуре получены и для других семейств рецепторов и ионных каналов. За редким исключением все они представляют собой совокупность нескольких субъединиц, каждая из которых состоит как минимум из двух трансмембранных доменов и участка, формирующего водную пору ионного канала.

Для успешного функционирования нервной системы нейроны должны обладать весьма разнообразным репертуаром электрической активности. Например, импульс, генерируемый одним из нейронов, может подавить электрическую активность соседних нервных клеток, активировать ряд отдаленных нейронов, и, наконец, плавно модулировать активность третьей группы нейронов. Все эти варианты поведения зависят, в конечном счете, от активации или деактивации ионных каналов, регулирующих ионные токи через мембраны нервных клеток.

Поэтому столь важно понимать, как функционируют ионные каналы. Это понимание базируется на знании молекулярной структуры белков каналов. Для большого числа ионных каналов определены последовательности аминокислот в белковой молекуле, а также предположительная конфигурация белка в плазматической мембране. В этой главе мы рассмотрим в деталях два типа ионных каналов. Первая группа — это лиганд-активируемые каналы, представленная никотиновым ацетилхоли новым рецептором. Вторая группа — потенциал-активируемые катионные каналы, которые обеспечивают движение


50                                       Раздел II. Передача информации в нервной системе

ионов натрия, калия и кальция через клеточную мембрану. Эти два типа каналов служат моделями, на которых базируются постулаты о структуре прочих каналов.

Как же выглядит молекула ионного канала и как она функционирует? В последние годы осуществлен значительный прогресс в понимании структуры ионных каналов. В получении этой информации были использованы два экспериментальных достижения. Во-первых, были изолированы клоны ДНК, кодирующие структуру ионных каналов, что позволило получить информацию об аминокислотной последовательности этих белков. Техника, используемая при этом, давала также возможность менять основания в молекуле ДНК (сайт-направленный мутагенез) и заменять, таким образом, в выбранном участке белка одну аминокислоту другой.

Вторым достижением была разработка техники, посредством которой клоны ДНК были использованы для экспрессии ионных каналов в чужеродных клетках, таких как ооциты Xenopus. Этот прием позволил оценить функциональные свойства клонированных ионных каналов электрофизиологическими методами. Комбинация двух методов позволяла манипулировать специфическими участками молекулы ионного канала, чтобы определить значение этих участков для его функционирования. Применение этих методов позволило выяснить, что в ряде случаев замена даже одной аминокислоты меняет ионную избирательность канала.

§ 1. Никотиновый ацетилхолиновый рецептор

Одним из первых изученных в деталях ионных каналов был никотиновый ацетилхолиновый рецептор (АХР). Заметим, что для лиганд-активируемых каналов предпочтительнее термин «рецептор», чем часто используемый термин «канал», так как характеристика таких белковых молекул в первую очередь зависит от связывания молекул агонистов, антагонистов, токсинов и антител, чем от специфических характеристик ионного канала. Никотиновые АХР представлены в постсинаптических мембранах скелетных мышечных волокон позвоночных, в нейронах нервной системы беспозвоночных и позвоночных, в синапсах электрического органа электрического ската.

Эти рецепторы активируются АХ, освобождающимся из пресинаптических нервных окончаний. При активации АХР открываются ионные каналы, через которые катионы могут проходить клеточную мембрану постсинаптической клетки. Рецепторы обозначаются как «никотиновые», поскольку действие АХ воспроизводится никотином, и для того, чтобы отличать их от других АХР, которые активируются мускарином. Мускариновые АХР сами не являются ионными каналами; их активация запускает систему внутриклеточных посредников, которые являются непосредственными регуляторами активности ионных каналов.

Биохимической изоляции никотинового АХР способствовало наличие концентрированного источника рецепторов в синаптических мембранах электрического органа ската Torpedo. Электрический орган этой и других подобных электрических рыб представляет собой редуцированные мышечные клетки (электроциты). Ряды электроцитов анатомически выстроены таким образом, что при одновременной их деполяризации общий разряд достигает 100 V — величину достаточную, чтобы оглушить добычу. После экстракции из мембран электроцитов молекулы АХР были отделены от других мембранных белков благодаря их высокому аффинитету (сродству) к -бунгаротоксину. Этот нейротоксин обладает высокой специфичностью по отношению к АХР в электроцитах и в скелетной мышце позвоночных. Было обнаружено, что АХР из Torpedo состоит из 4 белковых субъединиц (, ,  и ) с молекулярной массой около 40, 50, 60 и 65 кДа (килодальтон), соответственно. Изолированный АХР, после включения в искусственные липидные мембраны, сохраняет большинство функциональных характеристик, присущих нативному ионному каналу1).

Физические свойства АХР рецептора

Размер и ориентация ионного канала АХР по отношению к мембране были определены с помощью электронной микроскопии высокого разрешения, а также другими физическими методами 2) - 4). Физическая структура АХР показана на рис. 3.1. Пять субъединиц — две , одна , одна  и одна  — образуют кольцо вокруг центральной поры. Диаметр молекулы в ее самой широкой, внеклеточной части, составляет около 8,5 нм, а длина АХР —


Глава 3. Структура ионных каналов                                                    51

Рис. 3.1. АХ рецептор. (А) АХ рецептор состоит из пяти субъединиц — две , , одна , одна  и одна -субъединицы расположенных радиально с углом около 72°  вокруг центра,  -субъединицы содержат центры связывания АХ. Позиция - и -субъединиц может быть обратной. (В) Продольное и поперечное сечение электронно-микроскопического изображения цилиндрических везикул постсинаптической мембраны Torpedo, на котором показаны плотно расположенные АХ рецепторы. (С) Поперечный разрез такого цилиндра с большим увеличением. (D) Тот же объект под еще большим увеличением, на котором показан одиночный АХ рецептор.

 

Fig. 3.1. The ACh Receptor. (A) The complete AChR consists of five subunits— two a, one β, one 7, and one 6 — spaced radially in increments of about 72° around a central core. The a subunits contain receptor sites for acetylcholine. The position of the β and 7 subunits may be reversed. (B) Longitudinal and transverse electron microscope images of cylindrical vesicles from postsynaptic membranes of Torpedo, showing closely packed ACh receptors. (C) Transverse section of the tube at higher magnification. (D) Further enlarged image of a single ACh receptor, showing its position and size relative to the membrane bilayer. Dense blob under the receptor is intracellular receptor-associated protein. (A based on Stroud and Finer-Moore, 1985, and Toyoshima and Unwin 1988; B, C, and D kindly provided by N. Unwin.)

 

11 нм. Внеклеточная часть АХР выдается над поверхностью мембраны на 5 нм. Измерение избирательности ионного канала АХР по отношению к большим катионам предполагает, что диаметр центральной поры составляет примерно 0,7 нм 5, 6).

Аминокислотная последовательность субъединиц АХР

После предварительных биохимических исследований 7) были клонированы кДНК для всех субъединиц АХР и определены последовательности аминокислот 8) - 10) в каждой из них. Рис. 3.2 показывает аминокислотную последовательность -субъединицы АХР из электрического органа Torpedo (соответствующие субъединицы АХР человека и ко-

ровы несколько отличаются от представленной на рисунке). Аминокислотные последовательности других трех субъединиц весьма сходны (гомологичны) со структурой -субъединицы, с незначительными вариациями нескольких аминокислот. Поэтому принципы структурной конфигурации, обсуждаемые для -субъединицы, в основном применимы и других субъединиц.

Вторичная и третичная структура АХР

Хотя первичная структура субъединиц не дает информации о том, каким образом белковая молекула АХР организована в мембране, можно приблизиться к пониманию этого вопроса путем построения молекулярных


52                                   Раздел II. Передача информации в нервной системе

Рис. 3.2. Аминокислотная последовательность субъединицы АХР. Затемненные области показывают гидрофобные участки (M1, М2, М3 и М4), способные формировать трансмембранные -спирали.

Fig. 3.2. Amino Acid Sequence of the AChR Subunit. Sequences in color indicate hydrophobic regions (Ml, M2, M3, and M4) that are capable of forming membrane-spanning a helices. In the Ml region, 16 of the 22 amino acids are hydrophobic. The other membrane-spanning regions are of similar composition. The initial underscored segment is the signal sequence. (After Numa et al. 1983.)

моделей, основываясь на данных об аминокислотной последовательности белка. Логично предположить, что, как у любых крупных белков, сегменты молекулы свернуты в упорядоченные мелкие - или крупные -спирали. Эти вторичные структуры, в свою очередь, сворачиваются, образуя третичные структуры. Наконец, пять субъединиц (две , одна , одна  и одна ) соединяются вместе, формируя конечную четвертичную структуру — полноценный ионный канал.

Для построения модели вторичной и третичной структуры АХР существенную роль


Глава 3. Структура ионных каналов                                                    53

 

Рис. 3.3. Модель третичной  структуры субъединицы АХР, предположенная из анализа аминокислотной последовательности зтого белка.  Каждый из участков М1-М4 образует трансмембранные спирали, а оба терминальных участка (СООН и NH ) находятся во внеклеточном пространстве.

Fig. 3.3. Model of the Tertiary Structure of an AChR Subunit as proposed originally from amino acid sequence analysis. Regions Ml through M4 each form membrane-spanning helices, and both the carboxy (COOH) terminus and the amino (NH ) terminus of the peptide lie in the extracellular space.

сыграло обнаружение в первичной последовательности белка обширных участков неполярных (и, следовательно, гидрофобных) аминокислот, способных к формированию трансмембранного домена. В оригинальной модели АХР, предложенной Нума с коллегами 9), были идентифицированы четыре такие области (М1-М4, см. рис. 3.2), и была предложена структура, представленная на рис. 3.3. Используя индекс гидрофильности аминокислот в М1-М4 областях, можно самостоятельно проверить аргументированность этих заключений. Согласно последним данным, все трансмембранные участки, за исключением М2, являются скорее , чем -спиралями (см. рис.3.4А).

Как узнать, какая часть молекулы АХР является внеклеточной, а какая внутриклеточной? Прежде всего, на NН2-конце находится относительно гидрофобный участок из 24 аминокислот (рис. 3.2 и 3.5). Эта сигнальная последовательность необходима для проникновения синтезированного в клетке белка АХР в поверхностную мембрану. Следовательно, NН2-конец является внеклеточным. С этим согласуется тот факт, что два соседних цистеиновых остатка в позициях 192 и 193 ассоциированы с внеклеточным центром связывания АХ. Наконец, начальный внеклеточный сегмент составляет около половины от всей молекулы, что согласуется с известным распределением массы рецептора (см. рис. 3.1). Исходя из указанного четного числа трансмембранных участков, СООН-конец также является внеклеточным. Главные характеристики этой модели хорошо согласуются с другими наблюдениями. Например, в условиях плотной упаковки, АХР образуют димеры за счет дисульфидных связей между СООН-концами -субъединиц. Показано также, что такие дисульфидные мостики являются внеклеточными11· 12).

Структура и функция канала

Основной техникой сопоставления функции канала и его структуры является экспрессия ионных каналов в ооцитах Xenopus или в других клетках инъекцией соответствующей мРНК или трансфекцией ДНК с помощью векторов 13). После этой процедуры можно производить запись электрических сигналов либо от фрагментов мембраны, содержащих одиночные каналы, либо регистрировать токи целой клетки (отображающие поведение всей популяции экспрессированных каналов). Этому помогает то, что интактные ооциты сами не экспрессируют АХР. Однако после введения нуклеиновой кислоты, кодирующей АХР, они не только экспрессируют соответствующие субъединицы белка, но даже чудесным образом обеспечивают их сборку в функционально активные рецепторно-канальные комплексы.

Структура ионного канала может быть изменена сайт-направленным мутагенезом. Для осуществления этой методики необходимо сконструировать мутантную кДНК с мутациями, меняющими какой-либо сайт белка ионного канала. Это позволяет добиться того, что выбранные аминокислоты с присущими им физико-химическими свойствами (положительным или отрицательным зарядом, высокополярные или неполярные) заменяются другими аминокислотами с отличающимися свойствами. Функциональные свойства мутантных каналов могут затем быть изучены после экспрессии этого белка в клетках, в которые была введена мутантная кДНК.


54                                       Раздел П. Передача информации в нервной системе

Эмбриональный и взрослый типы АХР в мышце млекопитающих

По мере развития скелетной мышцы свойства АХР могут изменяться за счет замены эмбрионального типа на взрослый тип АХР. Эмбриональная форма рецептора отличается от взрослой формы АХР более продолжительным временем, которое ионный канал проводит в открытом состоянии, и меньшей проводимостью. В основе изменения свойств рецептора лежит то, что -субъединица, характерная для эмбрионального АХР, заменяется субъединицей с иной аминокислотной последовательностью 14). Эта связь изменений кинетики ионного канала и его проводимости с набором субъединиц, образующих АХР, подтверждена многочисленными экспериментами по инъекции различных комбинаций мРНК, кодирующей разные субъединицы АХР 15). Ооциты, инъецированные мРНК для -, -, - и -субъединиц, экспрессируют ионные каналы эмбрионального типа. После инъекции мРНК для -, -, - и -субъединиц, экспрессируются каналы со свойствами, подобными АХР в зрелой мышце.

Какие субъединицы АХР выстраивают пору?

Для получения информации об устройстве выстилки поры ионного канала был активно использован сайт-направленный мутагенез субъединиц АХР. Несмотря на наличие общих представлений о третичной структуре субъединиц АХР, наши знания о точном топологическом расположении трансмембранных сегментов и их участии в формировании стенки ионного канала гораздо более поверхностны. Такие характеристики исключительно важны, поскольку структура поры определяет ионную избирательность и проводимость канала. Один из подходов к решению данной проблемы состоит в проведении одной или нескольких мутаций в участке белка, предположительно вовлеченном в выстилку поры, и регистрации следующих за этим изменений избирательности и проводимости канала.

Другой подход может базироваться на способности стенки ионного канала связывать молекулы с определенными физико-химическими свойствами. Например, молекула местного анестетика QX-222 может блокировать ток через ионный канал за счет связывания с определенным сайтом внутри открытого канала АХР. Мутации субъединиц АХР показали, что М2 домены формируют часть стенки открытого канала 16), как изображено на рис. 3.4А. В частности, М2 домены - и -субъединиц АХР мыши содержат следующие аминокислотные последовательности (направление от цитоплазмы к внеклеточной среде, с нумерацией, относящейся к -субъединице; рис. 3.2):

Можно предположить, что гидрофильные аминокислоты, такие как серии (S) или треонин (Т), скорее всего обращены к водной поре, в то время как гидрофобный изолейцин (I) будет более вероятно контактировать с мембранными липидами. Когда серии из указанных позиций (отмечено подчеркиванием) был заменен слабо гидрофобным аланином, проводимость модифицированных ионных каналов снизилась почти наполовину. Кроме того, у мутантных каналов резко снизился аффинитет для QX—222. Эти эффекты согласуются с идеей о том, что серии образует стенку водной поры ионного канала АХР и вносит вклад в функциональные свойства ионного канала. Предполагается, что все выделенные на приведенном рисунке аминокислоты в составе -субъединицы принимают участие в образовании контура водной поры. Эти остатки были идентифицированы в экспериментах Карлин с коллегами 17), в которых каждый аминокислотный остаток -субъединицы от М243 до V261 по очереди заменяли на цистеин. Мутантная -субъединица была затем экспрессирована в ооциты вместе с интактнымиb, g и -субъединицами. Мембранные токи, продуцируемые АХ, измерялись до и после действия гидрофильного реагента MTSEA (этиламмония метанэтиосульфонат). Реагент мог избирательно реагировать с сульфгидрильной группой цистеина только в том случае, если замешенный цистеин находился в водной фазе. MTSEA ослаблял ответы на АХ (за счет блока ионного канала) в тех случаях, когда мутациям подвергались аминокислоты, выделенные на рисунке (Т244, L245, S248, L250, L251, S252, V255, L258). Эти результаты предполагают модель устройства стенки водной поры, образованной регулярной спиралью белковой молекулы, прерванной в середине вытянутой структурой, содержащей остатки 250, 251 и 252.


Глава 3. Структура ионных каналов                                                    55

Рис 3.4. Модель  структуры  субъединицы АХР, базирующаяся на электронно-микроскопическом   изображении. (А) Три спиральных элемента находятся во внеклеточной части канала, окружая и формируя устье АХР, обращенное в синаптическую щель. В пределах плоскости мембраны участки Ml, МЗ и М4 образуют крупные -спирали. М2 представляет собой изломанную мелкошаговую α-спираль, обращенную в просвет поры. (В) Поперечный срез рецептора, состоящего из пяти субъединиц.

Fig. 3.4. Proposed Model of the AChR Subunit Structure, based on electron microscope imaging. (A) Three helical elements lie within the extracellular region around the synaptic vestibule. Within the plane of the membrane, regions MX M3, and M4 form a b sheet. M2 is a split a helix extending into the pore region. (B) Cross sections of the complete receptor, consisting of five subunits, in the plane of the membrane. In the closed receptor, the M2 helices extend into the core of the structure. An open pore is created by the rotation of each helix toward the channel wall. The model is not in agreement with biochemical experiments that suggest that the gate is closer to the cytoplasmic end of the pore.

Структура АХР с высоким разрешением

Эффективным подходом для изучения топологии ионных каналов является анализ изображения мембранного белка, полученного электронной микроскопией с высоким разрешением, как показано на рис. 3.1. Д. Анвин18, 19), анализируя изображения АХР в везикулах из постсинаптических мембран Torpedo, достиг разрешения более чем 0,9 нм, раскрыв, таким образом, многие детали функционального устройства этого белка. Пять субъединиц по физическому устройству подобны друг другу, за исключением -субъединицы, которая имеет «карман», обращенный в синаптическую зону, и служащий, вероятно, центром связывания АХ. Принципиальные характеристики структуры субъединиц АХР суммированы на рис. 3.4А. В каждой субъединице вокруг внеклеточной входной части АХР найдены три участка с плотной упаковкой в виде -спиралей. Их физические позиции приблизительно такие, как показано на рисунке, но их очередность по отношению друг к другу пока неизвестна. Анализ среза изображения на уровне мембраны указывает на то, что в этой области каждая субъединица состоит только из одной спиральной структуры (вместо ранее предполагавшихся четырех) и обладает заметным изгибом в середине.

В полном рецепторе ансамбль из пяти центральных спиралей обрамлен кольцом плотного материала, образующим подобие звезды (рис. 3.4В). Предполагается, что центральные спирали являются формирующими пору М2 участками, а окружающее кольцо — -спирали оставшихся 15 трансмембранных доменов (три в каждой субъединице). По расчетам, окружность звездчатого кольца составляет приблизительно 20 нм, что близко к размерам, полученным при анализе изображений, зарегистрированных методом электронной дифракции.


56                                       Раздел П. Передача информации в нервной системе

Открытое и закрытое состояния АХР

На рис. 3.4А представлена одна из -субъединиц закрытого АХР, в котором изогнутый М2 участок вдается в пору. Для того чтобы получить изображение открытого АХР, Unwin апплицировал АХ в течение 5 мс перед быстрым замораживанием, захватывая, таким образом, рецепторы в открытом состоянии19). Это достигалось быстрым нанесением АХ на АХР-содержащие везикулы, которые сразу после этого падали в жидкий азот.

Сравнение изображений, полученных без АХ и после действия этого медиатора, показывает, что связывание АХ вызывает вращательное движение спиралей во внеклеточных участках АХР, что передается, по-видимому, на М2 спирали. Каким бы ни был механизм, в М2 спиралях появляется вращательное движение, направленное на перемещение этих участков от центра (см. рис. 3.4В), что в конечном счете приводит к открытию ионного канала АХР.

Точная локализация воротного механизма пока не определена. На основании структурных данных можно предположить, что ворота расположены вблизи изгиба М2 спирали, возможно, соответствуя лейцину в позиции 251 (L251) 19). Однако, эксперименты Karlin и коллег на мутантных каналах, экспрессированных в ооиитах, позволяют предположить, что ворота располагаются гораздо ближе к цитоплазматическому концу спирали20). Эти авторы нашли, что добавленный во внеклеточный раствор водорастворимый блокирующий реагент MTSEA проходил закрытую пору до глубины, соответствующей треонину в позиции 244 (Т244). Если же MTSEA добавлялся с цитоплазматической стороны, он практически не мог проникнуть в закрытый ионный канал АХР.

Разнообразие субъединиц нейронального АХР

После установления аминокислотной последовательности никотинового АХР подобные подходы по изоляции и секвенированию были предприняты по отношению субъединиц никотиновых АХР из вегетативных ганглиев и ЦНС. Эти рецепторы получили название «нейрональные никотиновые рецепторы». Субъединицы, аналогичные -субъединице мышечного рецептора, были идентифицированы по присутствию соседних цистеиновых остатков в проксимальной части NH2 конца (позиции 192 и 193 на рис. 3.2). Другие субъединицы были определены как "". Вместе с , , , и -субъединицами электрических органов и мышц эти субъединицы формируют семейство общего генетического происхождения.

Из мозга цыпленка и крысы были изолированы II субъединиц21· 22): 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 и 9, a также 2, 3 и 4. Инъекция в ооциты мРНК для 2, 3 или 4 субъединиц с 2 или 4 приводила к формированию функциональных каналов23). Каналы, формирующиеся из 2 или более типов субъединиц, принято называть гетеромультимерными. Экспрессия только лишь 7 субъединиц является достаточным для формирования гомомультимериых ионных каналов22). Это же верно и для 8 или 9 субъединиц. Наличие большого семейства субъединиц, пригодных для формирования канала, предполагает, что они могут быть специфическим образом скомбинированы, формируя разнообразные варианты ионных каналов с отличающимися функциональными свойствами, такими как ионная избирательность, проводимость и кинетические параметры.

Субъединичная композиция нейрональных АХР

Какое количество субъединиц необходимо для формирования нейронального АХР? Это было определено мутациями - и -субъединиц АХР цыпленка, менявшими в результате модификации проводимость ионного канала24). Совместная инъекция в ооциты кДНК для нормальной и мутантной -субъединицы вместе с кДНК, кодирующей нормальную -субъединицу, давала в результате три различных типа проводимости канала. Один из них был таким же, как проводимость обычных каналов, другой — таким же, как у каналов, кодированных только мутантной кДНК. Третий тип проводимости, по всей видимости, был представлен каналами с одной нативной и одной мутантной -субъединицей. По наличию одного (и только одного) промежуточного типа было сделано заключение, что обычный АХР содержит две -субъединицы. Вследствие инъекции нормальной и мутантной --субъединицы возникли каналы с четырьмя типами проводимости, указывающие на наличие трех не -субъединиц. На основании этих экспериментов было сделано заключение о том, что нейрональный АХР представляет собой пентамер со стехиометрией ()2()3·


Глава 3. Структура ионных каналов                                                    57

Рис. 3.5.   Гидропатические   индексы для аминокислотных последовательностей и -субъединиц САВА рецептора и одной субъединицы АХР. Положительные отклонения соответствуют гидрофобным аминокислотам, а отрицательные значения — гидрофильным остаткам.

Fig. 3.5. Hydropathy Indices for the ammo acid sequences of the GABA  and subunits and the AChR subunit. Indices are calculated by taking a moving sum of the individual indices of adjacent ammo acids in the sequence. Regions in the positive range are hydrophobic, those in the negative range hydrophilic. Light grey indicates principal hydrophobic regions; the four areas in similar positions toward the carboxy terminus correspond to the Ml through M4 regions of the ACh receptor. Dark grey regions are signal sequences. (Ammo acid numbering includes the signal sequence on the amino terminus.) (After Schofield et al., 1987.)

§ 2. Суперсемейства рецепторов ГАМК, глициновые и 5-НТ рецепторы

Три типа анионных (хлоридных) ионных каналов являются посредниками синаптического торможения в нервной системе. Все три типа каналов активируются аминокислотами: рецепторы типа А и типа С активируются -аминомасляной кислотой (ГАМКА25·26) и ГАМКС27) рецепторы) и глициновый рецептор (глиР) — аминокислотой глицином28). Каждый тип рецептора имеет несколько изоформ субъединиц, причем все они гомологичны субъединицам АХР. Например, для ГАМКА рецепторов идентифицировано шесть -, три -, три -, одна - и одна -субъединица. 5-НТ3 рецептор для серотонина образует катионный канал с функциональными свойствами, подобными никотиновому АХР29'. Была клонирована субъединица 5-НТ3 рецептора, известная как CEPl30). По аминокислотному составу CEPl, как и субъединицы ГАМК и глицинового рецепторов, сходна с субъединицами никотинового АХР.

Хотя АХ и 5-НТ3  рецепторы являются катион-избирательными, а ГАМК и глициновый рецепторы — анион-избирательными, сходство аминокислотных последовательностей в их субъединицах позволяет предположить, что все четыре семьи рецепторов имеют общее генетическое происхождение. Вместе они образуют общее генетическое суперсемейство31). Высокая степень гомологии аминокислотных последовательностей предполагает, что структуры более высокого порядка также будут подобны. Свидетельство такого структурного подобия представлено на рис. 3.5, на котором сравнивается индекс водорастворимости последовательных аминокислот, входящих в состав двух субъединиц ГАМКА рецептора и -субъединицы АХР. Как ясно следует из этого рисунка, все три пептида имеют сходные, профили с четырьмя гидрофобными последовательностями между аминокислотными остатками 220 и 500, указывающие на сходные трансмембранные домены. Подобные гидропатические профили показаны и для субъединиц глицинового и 5-НТ3 рецепторов. Таким образом, предполагаемая третичная структура субъединиц глицинового, ГАМК и 5-НТ, рецепторов аналогична таковой у субъединиц АХР (см. рис. 3.3).


58                                       Раздел II. Передача информации в нервной системе

Ионная избирательность лиганд-активируемых ионных каналов

Может вызвать удивление тот факт, чтр одно и тоже суперсемейство включает как катионные, так и анионные каналы. Каким образом селективность ионных каналов может различаться при столь очевидном структурном подобии? Одной из характерных черт строения ионных каналов является то, что их внемембранные части значительно выдаются над поверхностью мембраны (например, см. рис. 3.1). Unwin32) отмечает, что в катионных каналах стенки выступающего вестибюля канала имеют избыточный отрицательный заряд, тогда как анионные каналы в этих местах заряжены избыточно положительно. Так как открытый канал имеет около 2 нм в диаметре, а эффективный радиус электростатического взаимодействия в физиологических растворах составляет около 1 нм, положительный заряд в вестибюле канала может способствовать аккумуляции в нем отрицательных ионов, например, хлоридов в устье глицинового рецептора. Наоборот, в катионном канале в отрицательно заряженном вестибюле могут накапливаться положительно заряженные натрий и кальций. Аккумуляция ионов в вестибюле может способствовать процессу отбора анионным каналом анионов, а катионным каналом — катионов. Надо учесть также, что аккумуляция ионов будет способствовать увеличению проводимости каналов (напомним, что проводимость канала зависит от концентрации ионов).

§ 3. Потенциал-активируемые каналы

К каналам, специфически активируемым деполяризацией клеточной мембраны, относятся потенциал-активируемые натриевые каналы, отвечающие за фазу деполяризации потенциала действия, и потенциал-активируемые калиевые каналы, ассоциированные, с мембранной реполяризацией. В эту группу также входят потенциал-активируемые кальциевые каналы, которые в некоторых тканях отвечают за генерацию потенциала действия и поддержание длительной деполяризации, а также выполняют много других функций, таких как мышечное сокращение и освобождение нейротрансмиттеров. Каждое из этих трех семейств каналов имеет ряд изоформ, представленных у различных биологических видов и в разных частях нервной системы. Подобно АХР и его аналогам, они также составляют суперсемейство единого генетического происхождения.

Потенциал-активируемые натриевые каналы

Методы, которые были использованы для характеристики молекулярной структуры АХР, были также успешно применены к потенциал--активируемым каналам. Ключевыми шагами в этом процессе были биохимическая экстракция и изоляция протеина33) - 35) с последующим выделением клонов кДНК и расшифровкой аминокислотной последовательности36). Также как в случае АХР, электрические рыбы — на этот раз угорь Electrophorus electricus — явились богатым источником канального белка, а высокоаффинные токсины, такие как тетродотоксин (ТТХ) и сакситоксин (STX), обеспечили процесс изоляции протеина. Оба этих токсина блокируют ионную проводимость нативных каналов, закупоривая пору открытого канала. Позже натриевые каналы были изолированы из мозга и скелетной мышцы. Натриевый канал, выделенный из электрического угря, состоит из одного крупного (260 кД) пептида и является типичным представителем семейства структурно сходных протеинов.

В мозге млекопитающих ключевая 260 кД -субъединица натриевого канала ассоциирована с двумя дополнительными субъединицами: 1 (36 кД) и 2 (33 кД). Показано, что присутствие 1 -субъединицы значительно повышает скорость инактивации натриевого канала 37). В мозге было найдено несколько различных вариантов мРНК, кодирующих -субъединицу, что объясняет наличие разных подтипов натриевого канала. По крайней мере два дополнительных изоформы натриевого канала выделены из скелетной мышце млекопитающих — одна из взрослой мышцы (RSkMl)38), и другая, характерная для эмбриональной или денервированной мышцы (RSkM2)39). Третья изоформа этого канала обнаружена в сердечной мышце


Глава 3. Структура ионных каналов                                                    59

Рис. З.6. Структура потенциал активируемых каналов. (А) Потенциал активируемые натриевые каналы, представляющие одну белковую молекулу с четырьмя доменами (I-IV), соединенными внутриклеточными петлями. Каждый домен имеет шесть трансмембранных участков (S1-S6). Структура, формирующая ионную пору, располагается между пятым и шестым сегментом. (В) Структура потенциал-активируемых кальциевых каналов подобна таковой натриевого канала. (С) Субъединица калиевого канала похожа на одиночный домен натриевого канала. (D) Предполагаемая трехмерная структура канала.

Fig. З.6. Figure 3.6 Voltage-Activated Channel Structure. (A) Voltage-activated sodium channel, represented as a single protein with four domains (I-IV) connected by intracellular loops. Each domain has six transmembrane segments (S1-S6), with a pore-forming structure between the fifth and sixth. (B) The structure of voltage-activated calcium channels is similar to that of the sodium channel. (C) The potassium channel subunit resembles a single domain of the sodium channel. (D) The proposed three-dimensional channel structure, with the domains in a circular array and the S5-S6 connectors dipping into the pore. The relative positions of SI through S6 in each domain are not known and thus are shown arbitrarily.


60                                      Раздел II. Передача информации в нервной системе

млекопитающих40). После трансляции происходит интенсивное гликозилирование канального белка. Так, около 30 % массы натриевого канала угря составляют углеводы, содержащие большие количества сиаловой кислоты.

Аминокислотная последовательность и третичная структура натриевого канала

Натриевый ионный канал угря представляет собой пептид с последовательностью из 1832 аминокислот, в котором выделяют четыре следующих другом за другом домена (I-IV), каждый из которых содержит от 300 до 400 остатков. Эти домены имеют примерно 50%-ную гомологию аминокислотных последовательностей. Каждый домен является структурным эквивалентом одной субъединицы канальных белков семейства АХР. Однако в отличие от АХР все домены натриевого канала соединены вместе в единый белок. В пределах каждого домена есть множественные гидрофобные или смешанные гидрофобно/гидрофильные (амфотерные) последовательности, обеспечивающие формирование трансмембранных сегментов.

Согласно общепринятой модели топологии канала (рис. 3.6А) каждый домен имеет шесть таких трансмембранных сегментов (S1-S6). Так же как в случае АХР, домены натриевого канала располагаются кольцом вокруг поры ионного канала (рис. 3.6D). Особенно интересен сегмент S4, который имеется во всех четырех доменах и несет положительно заряженный аргининовый или лизиновый остаток в каждой третьей позиции трансмембранного сегмента. Предполагается, что это свойство обеспечивает чувствительность канала к электрическому полю и оно имеется у всех потенциал-активируемых ионных каналов (глава 6).

Потенциал-активируемые кальциевые каналы

Семейство потенциал-активируемых кальциевых каналов содержит несколько подтипов, которые были классифицированы по их функциональным свойствам, таким как чувствительность к деполяризации мембраны и продолжительность открытого состояния (табл. 3.1) 41· 42). Изоформы кальциевых ионных каналов были клонированы из скелетной, сердечной и гладкой мышцы, а также из мозга. Аминокислотная последовательность первичной канал-формирующей субъединицы () подобна аналогичной субъединице потенциал-активируемого натриевого канала43). В частности, трансмембранные сегменты S1—S6 гомологичны таковым натриевого канала. На основании этого предполагается, что кальциевый и натриевый каналы имеют одинаковую третичную структуру (рис. 3.6В).

Хотя для формирования функционирующего кальциевого канала в чужеродных клетках достаточно только -субъединицы, в нативных клеточных мембранах найдены три дополнительные субъединицы: 2, димер с внеклеточным 2-пептидом, связанным с трансмембранным -пептидом дисульфидной связью; , внутриклеточный примембранный белок, и , интегральный белок с четырьмя трансмембранными доменами. Коэкспрессия различных комбинаций субъединиц позволила предположить, что 2- и -субъединицы влияют как на проводимость канала, так и на его кинетику, а -субъединица обеспечивает потенциал-чувствительность канала44).

Потенциал-активируемые калиевые каналы

Потенциал-чувствительные калиевые каналы играют важную роль в процессах возбудимости и проводимости. Целый ряд разных генов кодирует разнообразные типы калиевых каналов. Первый калиевый канал, у которого была установлена аминокислотная последовательность, был выделен у Drosophila. Он был назван Shaker по генетическому мутанту, у которого был обнаружен дефект этого канала45). Особенность этих мутантных мушек заключалась в том, что они трепетали (shaking), когда для их подсчета их анестезировали эфиром. Столь легко распознаваемая мутация обеспечила удобный методический подход для клонирования этого калиевого канала, не требующий обязательной идентификации белка. Генетический анализ позволил установить область примерного расположения гена Shaker в геноме Drosophila. Последующее сопоставление нормальной и мутантной последовательностей в этой области привело к идентификации гена shaker.

Неожиданным было то, что аминокислотная последовательность полученного белка оказалось намного короче таковой у потенциал-активируемого натриевого или кальциевого канала. Пептид калиевого канала содержал


Глава 3. Структура ионных каналов                                                   61

Таблица 3.1. Функциональная классификация потенциал-зависимых кальциевых каналов и соответствующие клоны субъединиц.

Table 3.1. Functional classification of voltage-activated calcium channels and corresponding clones of a subunits.

a Designations T, L, and N originally meant Transient, Long-lasting, and Neither Т nor L; Ρ refers to Purkinje cells.

b HV and LV indicate high-voltage and low-voltage thresholds for opening.

c Lowercase designations a and b indicate splice variants.

только один домен (см. рис. 3.6В), подобный IV домену натриевого канала угря. Экспериментальные данные указывают на то, что в мембране отдельные субъединицы калиевого канала объединяются, формируя мультимерные ионные каналы46). У Drosophila были клонированы четыре отдельных подсемейства калиевых каналов (названные Shaker, Shab, Shaw, Shal). У млекопитающих найдены аналоги для всех этих типов (табл. 3.2). Каждое подсемейство представлено различными изоформами (Shakerl, Shaker2 и т.д.). Изоформы одного и того же подсемейства после экспрессии способны формировать гетеромультимерные каналы, тогда как изоформы, принадлежащие разным подсемействам, такой способностью не обладают47).

Подобно натриевому и кальциевому каналам, потенциал-активируемые калиевые каналы обычно экспрессируются вместе с дополнительными () субъединицами48). Идентифицировано два подсемейства этих дополнительных субъединиц: Κν1.1-Κν1.3 и Κν2.1. Экспрессированные с основными субъединицами, -субъединицы определяют потенциал-чувствительность и инактивационные свойства калиевых каналов.

Сколько субъединиц в калиевом канале?

Сравнение структуры калиевого канала со строением родственных натриевого и кальциевого каналов (рис 3.6) позволило высказать предположение, что полноценный калиевый канал представлен ансамблем четырех субъединиц (тетрамером). Для изучения этого вопроса были проведены эффектные эксперименты с блокатором калиевого канала charybdotoxin (СГХ) в сочетании с использованием мутантов, резистентных к данному токсину49). Субъединицы нативного и мутантного типов калиевого канала Drosophila были экспрессированы в ооцит в разных пропорциях. При использовании только нативных субъединиц калиевого канала, формирующих гомомультимерные каналы, калиевые токи в мембране ооцита полностью блокировались высокими концентрациями СТХ. Мутантные каналы при этом практически не блокировались.

Таблица 3.2. Гены субъединиц потенциал-зависимого калиевого канала у дрозофилы и соответствующие гены млекопитающих.

Table 3.2. Voltage-activated potassium channel subunit genes in Drosophila, and corresponding mammalian genes.

Drosophila gene

Mammalian genes

Shaker 1 to 12

Kv 1.1 to 1.12

Shab 1 and 2

Kv2.1 and 2.2

Shaw 1 to 4

Kv3.1 to 3.4

Shal 1 and 2

Kv4.1 and 4.2


62                                      Раздел II. Передача информации в нервной системе

Токи в ооцитах, инъецированных как мутантной, так и нативной мРНК, блокировались лишь частично.

Для трактовки этих экспериментов ключевое значение имел тот факт, что связывание СТХ даже одной субъединицей канала уже достаточно для блокирования всего канального комплекса и прекращения тока. Следовательно, в ооцитах, инъецированных смесью нативного и мутантного типов, незатронутыми токсином останутся только гомомультимерные каналы, образованные исключительно мутантными субъединицами. Фракция таких каналов, сформированных случайной ассоциацией субъединиц нативного и мутантного типов, может быть подсчитана по соотношению количества инъецированной мРНК для мутантного и нативного типов канала. Например, если канал состоит из четырех субъединиц и 90% РНК является мутантной, то вероятность формирования каналов, состоящих только из мутантных субъединиц, составит ([0,9]4), или 66%. Оставшиеся 34 % каналов будут иметь по меньшей мере одну субъединицу нативного типа и будут подвержены блокирующему действию токсина. Аналогичный подсчет предсказывает, что блокирующий эффект СТХ должен составить 27 % для каналов-тримеров (каналов, состоящих из 3 субъединиц) и 41 % для пентамеров (5 субъединиц). Поскольку в указанных экспериментах наблюдалось блокирование каналов на 34%, удивительно совпадающее с предсказанием, было сделано заключение о тетрамерной структуре калиевых каналов.

Строение поры потенциал-активируемых каналов

Общим признаком аминокислотных последовательностей всех потенциал-активируемых каналов является умеренно гидрофобный участок во внеклеточной петле между S5 и S6 сегментами (рис. 3.6). Так же как в экспериментах, описанных ранее для М2 участка АХР, мутации в этом участке калиевого канала Shaker снижали сродство канала для блокирующего действия тетраэтиламмония (TEA) и изменяли проводимость канала50· 51). Было сделано заключение, что этот участок погружен вглубь канала и принимает участие в формирования ионной поры52). Этот вывод подтверждался также данными рентгеновской дифракции канала (см. рис. 3.7). Петля S5—S6 формирует короткую спираль, которая погружена в центр канала; аминокислоты, восходящие от нижнего конца спирали, образуют верхнюю часть ионной поры (см. рис. 3.6D). Мутации в области поры существенно затрагивают ионную избирательность потенциал-активируемых ионных каналов. Например, в натриевых каналах мозга крысы замена в области поры в третьем домене положительно заряженного глутамата на отрицательно заряженный лизин приводит к появлению характеристик, свойственных кальциевым каналам53). Вместо селективной проницаемости для натрия мутантный канал имеет низкую избирательность для моновалентных катионов. Кроме того, при физиологических концентрациях ионов, большая часть тока через такой канал обеспечивается кальцием.

Анализ структуры калиевого канала с высоким разрешением

Структура калиевых каналов Streptomyces lividans (KCSA каналы) была изучена рентгеновской кристаллографией с разрешением 3,2А54). Бактериальные каналы относятся к классу калиевых каналов, субъединицы которых вместо шести трансмембранных доменов имеют только два. Другим примером такого двух-доменного белка является калиевый канал внутреннего выпрямления, который будет обсуждаться позже (см. рис. 3.8). Два сегмента калиевого канала являются структурными эквивалентами сегментов S5 и S6 в потенциал-активируемых каналах. Несмотря на разное число трансмембранных сегментов, аминокислотная последовательность в пору-формирующей петле S5-S6 удивительно консервативна у всех калиевых каналов 53· 55). Преимуществом исследования бактериального калиевого канала является то, что он может быть продуцирован в больших количествах, достаточных для кристаллизации, что делает возможным проведение рентгеновской дифракции.

KCSA канал является тетрамером. Рис. 3.7 представляет канал в разрезе и показывает большую часть его структурных деталей. Рядом с NH2-концом каждой субъединицы имеется наружная спираль, которая пронизывает мембрану от цитоплазматической стороны до наружной поверхности. За наружной спиралью следует короткая спираль, направленная в пору. Затем располагается внутренняя спираль, которая возвращается к цитоплазматической стороне. Соединяющие петли меж-


Глава 3. Структура ионных каналов                                                    63

Рис. 3.7. Структура калиевого кана ла. Поперечный срез калиевого канала К А типа, показывающий две из четырех субъединиц. Каждая субъединица имеет две трансмембранных спирали и короткую спираль, обращенную в пору. Петли, идущие от короткой спирали, образуют селективный фильтр канала.

Fig. 3.7. Potassium Channel Structure. Sectional view of a KSCA potassium channel showing two of four subumts, one on either side of the central pore. Each subunit has two membrane-spanning helices and a short helix pointing into the pore. The connections between the outer helices and the short helices of the four subunits form four turrets that surround the pore entrance and contain binding sites for blocking molecules. The four connections between the short helices and the inner helices combine to form the selectivity filter, which allows the permeation of potassium, cesium, and rubidium but excludes smaller cations such as sodium and lithium. (After Doyle et al., 1998.)

ду наружной и короткой спиралями образуют четыре возвышения, окружающие наружное отверстие поры и содержащие связывающие сайты для TEA и других блокирующих канал токсинов 53). В каждой субъединице петля между центральным концом короткой спирали и внутренней спиралью формирует структуру ионной поры. Четыре такие петли, объединяясь, образуют узкий проход, ответственный за ионную избирательность канала — селективный фильтр. Относительно большая центральная полость и нижняя внутренняя пора соединяют селективный фильтр с цитоплазмой.

Избирательность для калия достигается как размером, так и молекулярным строением селективного фильтра. Диаметр фильтра составляет около 0,3 нм и аминокислоты в его стенке ориентированы таким образом, что последовательные кольца, образованные четырьмя карбоксильными группами (по одной от каждой субъединицы), обращены внутрь поры. Диаметр поры достаточен для прохождения дегидратированного иона калия (диаметром около 0,27 нм). Следует заметить, что дегидратация проникающего иона могла бы потребовать значительной энергии (глава 2). Однако этот фактор минимизируется за счет кислорода стенки канала, который заменяет атомы кислорода воды в гидратированной молекуле. Ионы меньшего размера, такие как натрий (диаметр 0,19 нм) или литий (диаметр 0,12 нм), не способны проникнуть через калиевый канал, поскольку они не могут сформировать достаточно плотный контакт одновременно со всеми четырьмя кислородами, поэтому они остаются гидратированными. Ионы большего размера, такие как цезий (диаметр 0,33 нм), не могут проникнуть через пору из--за своих размеров. Эти структурные основы ионной избирательности вполне согласуются с традиционными воззрениями на ионную проницаемость каналов56).

Исследователи надеются, что метод рентгеновской дифракции сможет обеспечить новыми данными о пока еще малоизученных структурных изменениях, происходящих при открытии ворот калиевого канала. Например, загадкой является локализация ворот, поскольку в калиевых каналах Shaker приложенные с цитоплазматической стороны вещества имеют при открытом канале свободный доступ вглубь поры, хотя тогда, когда каналы закрыты, они могут проникать внутрь канала только на очень короткую дистанцию. Следовательно, ворота должны находиться совсем рядом со входом, с цитоплазматической стороны ионной поры57).


64                                      Раздел II. Передача информации в нервной системе

§ 4. Другие каналы

Помимо перечисленных ранее, в нейронах имеется еще довольно много иных ионных каналов, принципиально важных для функционирования нервной системы. Для многих из этих каналов были определены детали их молекулярного устройства. Среди них представлено семейство глутамат-активируемых каналов, семейство АТФ-активируемых каналов и многие другие. Клонированы представители большого семейства потенциал-активируемых хлорных каналов, а также определены аминокислотные последовательности субъединиц, формирующих потенциал-чувствительные калиевые каналы внутреннего выпрямления. Кроме того, установлены структуры ионных каналов, активируемых внутриклеточными лигандами.

Главной закономерностью, установленной к настоящему времени, является то, что для формирования ионного канала необходим, как правило, ансамбль четырех или более белковых субъединиц (или в случае потенциал-активируемых натриевых и кальциевых каналов — наличие четырех повторяющихся доменов одного белка). Во многих случаях реальное число субъединиц, образующих канал, зачастую остается неизвестным, хотя для потенциал-чувствительных каналов и катионных каналов, активируемых внутриклеточными лигандами, предполагается тетрамерная структура. В отличие от этого, для каналов, активируемых внеклеточными лигандами, общепринятым считается наличие пяти субъединиц. Далее приведены некоторые примеры таких каналов.

Потенциал-активируемые хлорные каналы

Впервые потенциал-акта внруемые хлорные каналы были клонированы из электрического органа Torpedo58). Известные как CLC-0 каналы, они с высокой плотностью экспрессированы в неиннервированной части клеток этого органа, предоставляя собой низкоомный путь распространения токов, генерируемых в иннервированной области клетки. Ген, кодирующий CLC-0, обнаружен также в мозге млекопитающих и относится к большому семейству, которое включает, по меньшей мере, восемь других гомологичных генов59). CLC-1 хлорные каналы, найденные в скелетной мышце млекопитающих, вносят ведущую роль в проводимость мембраны мышечных

волокон. В частности, они стабилизируют заряд мембраны на уровне потенциала покоя. CLC-2 каналы ассоциированы с регуляцией объема клетки и обладают чувствительностью к растяжению мембраны. Две другие изоформы хлорных каналов, CLC-K1 и CLC-K2, отвечают за реабсорбцию хлорида в почках.

До сих пор остаются некоторые неясности в трансмембранной топологии хлорных каналов CLC, что в значительной мере зависит от различной трактовки гидропатического анализа аминокислотной последовательности белка канала 60). CLC каналы состоят из 13 гидрофобных доменов, 11 из которых с высокой вероятностью расположены внутри мембраны (рис. 3.8). Особенностью этих хлорных каналов является наличие протяженного гидрофобного участка D9-D10, конфигурация которого в мембране пока неизвестна. Экспериментальные данные позволяют предположить, что CLC-0 функционирует в мембране как димер, необычным свойством которого является то, что каждая субъединица формирует в мембране свой собственный независимый канал 61).

Калиевые каналы внутреннего выпрямления

Калиевые каналы внутреннего выпрямления (Kir каналы) обеспечивают движение ионов калия в клетку тогда, когда мембранный потенциал отрицателен по отношению к равновесному потенциалу калия, хотя они практически не поддерживают движения калия наружу клетки. Имеется по крайней мере пять подсемейств канала Kirl—КiГ5, обнаруженных в мозге, сердце и почках 62· 63). Одно семейство, Кir3, формирует каналы, активируемые внутриклеточными G-белками (глава 10). Эти каналы могут быть заблокированы внутриклеточным магнием и/или внутриклеточными полиаминами. Предполагаемая структура субъединиц Kir (рис. 3.8В) подобна таковой у канала KCSA с двумя трансмембранными доменами. Магний-связывающий сайт, блокирующий активность Kir каналов, располагается предположительно на М2 домене в области цитоплазматического конца канала.

АТФ-активируемые каналы

Аденозин-5'-трифосфат (АТФ) выполняет функцию нейротрансмиттера в гладкомышечных клетках, в клетках автономных ганглиев и в нейронах центральной нервной


Глава 3. Структура ионных каналов                                                    65

Рис. 3.8. Примеры отдельных типов каналов. (А) Белок потенциал активируемого хлорного канала предположительно имеет 11 трансмембранных участка. Димеры этого канала в мембране образуют два независимых канала. (В) Вторичная структура калиевого канала входного выпрямления с двумя трансмембранными доменами петлей, образующей пору. Полный канал, по-видимому, тетрамер (С) Структура АТФ рецептора сходная со структурой канала входного выпрямления. (D) Субъединица глутаматного рецептора с тремя трансмембранными спиралями и образующая пору петля, исходящая с цитоплазматической стороны. Полный канал, по-видимому, пентамер. (Е) Строение субъединицы канала, активируемого цАМФ или цГМФ, подобно строению потенциал активируемого калиевого канала (рис. 3.6) Полный канал, по-видимому, тетрамер.

Fig. 3.8. Examples of Distinctive Types of Channels. (A) The voltage-activated chloride channel protein is thought to have 11 membrane-spanning regions; the arrangement of segment D9-D10 is not known. The protein is believed to assemble in the membrane as a dimer to form a "double-barreled" channel structure. (B) Proposed secondary structure of a subunit of the inward-rectifying potassium channel, with two membrane-spanning regions and a pore-lining loop. The complete channel is assumed to be a tetramer. (C) The subunit structure of receptors for ATP appears similar to that of the inward rectifier. (D) Glutamate receptor subunits are believed to have three transmembrane helices and a pore-forming loop entering the channel from the cytoplasmic side. The complete receptor is thought to be a pentamer. (E) The subunit structure of channels activated by cyclic AMP or cyclic GMP is similar to that of voltage-activated potassium channels (see Figure 3.6C). Complete channels are assumed to be tetramers.

системы 64, 65). Так как АТФ является пурином, его рецепторные молекулы известны как пуринергические рецепторы. Один из них Р2Х рецептор, лиганд-активируемый катионный канал. Клонировано семь субъединиц Р2Х рецептора (Р2Х1-Р2Х7) 66). Их предполагаемая третичная структура (рис. 3.8С) с двумя трансмембранными участками подобна таковой у субъединиц канала KCSA.

Глутаматные рецепторы

Глутамат является наиболее важным и наиболее распространенным возбуждающим нейротрансмиттером центральной нервной систе-


66                                             Раздел II. Передача информации в нервной системе

мы, активирующим, по меньшей мере, три типа катионных каналов. Все три типа рецепторно-канальных комплексов обладают различными функциональными свойствами и отличаются друг от друга по чувствительности к разным аналогам глутамата 67). Один из рецепторов, называемый NMDA-рецептор, избирательно отвечает на N-methyl-D-aspartate (NMDA). Два других рецептора активируются соответственно АМРА (-amino3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionic acid) или каинатом. Благодаря избирательности, три этих агониста (NMDA, АМРА, каинат) являются важными экспериментальными инструментами для селективной активации соответствующего типа глутаматного рецептора. При этом следует помнить, что естественным трансмиттером для всех трех типов рецепторов является только глутамат, но не его аналоги.

Молекулярное клонирование позволило идентифицировать кДНК для 16 субъединиц глутаматного рецептора. Пять из этих субъединиц, названные NR1 и NR2, могут принимать участие в формировании NMDA-рецептора. АМРА-рецепторы сформированы другими типами субъединиц, обозначаемых как GluRA-GluRD (или GluRl-GluR4). Каинатные рецепторы собраны из субъединиц КА1 и/или КА2 в комбинации с GIuR5, 6 или 7. Для двух гомологичных субъединиц глутаматного рецептора, t и 2, принадлежность к какому-либо отдельному рецептору остается пока не установленной. По аналогии с никотиновым АХР считается, что глутаматные каналы являются также пентамерами, хотя на этом подобие между ними заканчивается Аминокислотная последовательность субъединиц глутаматного рецептора 68) - 70) примерно вдвое длиннее таковой суперсемейства, включающего АХР, 5-НТ3, ГАМК и глициновые рецепторы. Кроме того, между двумя этими суперсемействами практически нет гомологии.

Поскольку субъединицы глутаматного рецептора имеют четыре трансмембранных сегмента, поначалу считали, что они располагаются в мембране так же, как у АХР (см. рис. 3.3). Однако последние данные позволяют представить строение глутаматных каналов так, как это изображено на рис. 3.8D. Согласно этому представлению, второй сегмент вступает в мембрану с цитоплазматической стороны, образуя петлю-шпильку, выстилающую пору. Эта уникальная для глутаматного рецептора конфигурация подтверждается и данными мутагенеза данной петли ионного канала 72).

Каналы, активируемые циклическими нуклеотидами

Рецепторы сетчатки и обонятельного эпителия активируются внутриклеточным циклическим АМФ или циклическим ГМФ 73, 74). Рецепторы формируют ионные каналы, с различной избирательностью для калия, натрия или кальция. Аминокислотная последовательность субъединиц нуклетид-активируемых ионных каналов имеет некоторую гомологию с субъединицами потенциал-чувствительных каналов. Предполагаемая структура каналов (рис. 3.8Е) включает шесть трансмембранных участков, что хорошо согласуется с гидропатическими индексами этих белков. Участок S4 представлен регулярно повторяющимися заряженными остатками, хотя число их ниже, чем у потенциал-чувствительных каналов. В соответствии с активацией внутриклеточными лигандами, большая часть массы белка канала находится на цитоплазматической стороне мембраны. Наиболее вероятной формой объединения субъединиц является тетрамер.

§ 5. Разнообразие субъединиц

Характерной особенностью ионных каналов является широкое разнообразие изоформ субъединиц. Существует больше дюжины вариантов субъединиц никотинового АХР и еше большее число субъединиц калиевого канала и глутаматного рецептора. Как возникает такое разнообразие? В основе этого лежит прежде всего то, что каждый канал или субъединица канала кодированы отдельным геном. Кроме того, установлены два других механизма, приводящих к появлению субъединиц с различающими свойствами.

Во-первых, это альтернативный сплайсинг. Большинство белков кодированы в различных сегментах ДНК, так называемых экзонах. В некоторых случаях экзоны вместо комбинации в единственный вариант мРНК, контролирующий синтез специфической субъединицы, образуют различные альтернативные комбинации, что приводит к созданию мРНК для множественных изоформ субъединиц. Во время транскрипции неизвестный регулирующий механизм определяет, какая из альтернативных мРНК будет использована для синтеза


Глава 3. Структура ионных каналов                                                    67

белка. Остаток исключается из транскрипта и оставшиеся сегменты РНК соединяются, формируя конечную мРНК. Например, именно таким путем образуются изоформы калиевого канала типа Shaker.

Второй способ достижения разнообразия субъединиц — редактирование РНК. Примером являются субъединицы глутаматных рецепторов GluRB, GluR5 и GluR6. Эти субъединицы в середине второго трансмембранного сегмента содержат либо глютаминовый, либо аргининовый остаток (рис. 3.8D). Присутствие аргинина устраняет кальциевую проницаемость ионного канала и уменьшает его проводимость. Таким образом, хотя ДНК всех трех субъединиц для этого сайта содержит глютаминовый кодон (CAG), на уровне мРНК, в соответствующем участке может появиться кодон для аргинина (CGG)75). Это изменение в базовой последовательности нуклеиновых кислот достигается редактированием РНК в ядре клетки. Таким образом, например, редактируется процесс синтеза GluRB и отчасти синтез GluR5 и GluR6. В GluR6 дополнительное редактирование A/G найдено в первом трансмембранном сегменте 76).

Заключение

Современными методами биохимии, молекулярной и клеточной биологии, электронной микроскопии, электронной и рентгеновской дифракции получена детальная информация о молекулярной организации и структуре каналов и рецепторов. Мы знаем, например, что каналы образованы четырьмя или более субъединицами или доменами, собранными в определенном порядке вокруг центральной поры. Каждая субъединица или домен включает, в свою очередь, от двух до шести трансмембранных участков, объединенных вне- и внутриклеточными петлями. Ансамбль, состоящий из субъединиц, составляет структуру, достаточную, чтобы на адекватный сигнал образовать пору, пропускающую ионы. Каналы, являющиеся относительно избирательными, такие как потенциал-зависимые каналы, обычно представляют собой тетрамеры; более крупные и менее избирательные лиганд-активируемые каналы являются пентамерами. Как продолжение этого принципа наиболее крупные каналы — щелевые контакты — имеют гексамерную структуру (глава 7). Для некоторых каналов до сих пор остается неясной функциональное предназначение

ряда трансмембранных участков субъединиц. Однако имеется несколько примеров, в которых функция отдельных участков достаточно твердо установлена. Например, четко доказано, что М2 участок субъединиц суперсемейства АХР формирует стенку ионной поры и воротный механизм. Рентгеновская дифракция выявила структурную основу ионной избирательности калиевых каналов. Этот результат может быть экстраполирован на другие каналы, имеющие подобные первичные последовательности, такие как потенциал-зависимые каналы, каналы внутреннего выпрямления, каналы, активируемые циклическими нуклеотидами, и каналы, активируемые АТФ. Большинство исследователей считает, что трансмембранные участки каналов представляют собой -спирали. Структурные исследования подтвердили это предположение для KCSA канала, но не для никотинового АХР, у которого М2 сегмент представлен более крупной -спиралью.

Внемембранные петли, соединяющие трансмембранные участки, обеспечивают ряд специфических функций, наиболее важной из которых является формирование центров связывания внутриклеточных и внеклеточных лигандов, регулирующих функции канала. Кроме того, накопление ионов во внемембранных устьях канала помогает регулировать ионную избирательность и повышает проводимость канала. Многие детали молекулярного устройства каналов остаются невыясненными, но, вооруженные современными техническими возможностями, мы можем надеяться на быстрый прогресс наших знаний о молекулярной основе функционирования нервной системы.

Выводы

∙  Никотиновые ацетилхолиновые рецепторы электрического органа Torpedo состоят из пяти субъединиц (две и три другие, обозначаемые и ), группирующихся вокруг центральной поры, -субъединицы содержат связывающие сайты для АХ.

∙  В   каждой   субъединице   АХ   рецептора имеется четыре трансмембранных участка (ΜΙ—Μ4), объединенных внутри- и внеклеточными петлями. Показано, что М2 участок белка формирует пору ионного канала.


68                                   Раздел II. Передача информации в нервной системе

∙  Из нервной системы выделены одиннадцать отдельных субъединиц никотинового АХ рецептора,  восемь из которых имеют сайты, связывающие АХ (и обозначаемые как 29), и три других обозначаются 2-4· Большинство комбинаций --субъединиц могут формировать функциональные каналы, способные отвечать на АХ.

∙  Субъединицы рецепторов -аминомасляной кислоты  (ГАМК), глицина и серотонина (5-НТ) аналогичны по структуре субъединицам АХ рецептора. Вместе четыре этих семейства рецепторов образуют суперсемейство, имеющее общее генетическое происхождения.

∙   Потенциал-активируемый натриевый канал электрического органа угря является одиночной молекулой, состоящей из 1 800 аминокислот.  Этот канал имеет четыре крупных повторяющихся домена (I-1V). Домены являются архитектурными эквивалентами   субъединиц  других   каналов; внутри каждого имеется шесть трансмембранных участков (S1-S6), соединенных внутри- и внеклеточными петлями. Натриевый ионный канал угря является прототипом разнообразных изоформ этого канала, представленных в мышцах и мозге.

∙  Семейство потенциал-активируемых кальциевых каналов аналогично по структуре натриевому каналу. Потенциал-активируемые калиевые каналы структурно подобны натриевым и кальциевым каналам, но с  важным  отличием: у  них четыре повторяющихся домена экспрессированы как  отдельные  субъединицы,  а  не  как повторяющиеся  домены  одной  молекулы. Существует по меньшей мере 20 генов, контролирующих экспрессию субъединиц калиевого канала. Калиевые каналы группируются в четыре отдельных подсемейства.  Потенциал-активируемые натриевый, кальциевый и калиевый каналы составляют вместе единое суперсемейство.

∙  Субъединицы других лиганд- и потенциал-активируемых ионных каналов значительно различаются как размерами, так и аминокислотным составом. Некоторые имеют сходство с субъединицами потенциал-активируемых каналов, но большинство заметно отличаются от представителей как потенциал-, так и АХ-активируемых каналов. Некоторые имеют только два или три трансмембранных домена, а другие могут иметь больше 10 таких доменов.

Рекомендуемая литература

о Akabas, M. H., Kauflhian, C., Archdeacon, P., and Karlin, A. 1994. Identification of acetylcholme receptor channel-linning residues in the entire M2 segment of the α subunit. Neuron 13: 919-927.

о Doyle, D. A., Cabrai, J. M., Pfeutzner, A. K.,Gulbis, J. M., Cohen, S. L., Chait, B.T., and McKinnon, R. 1998. The structure of the potassium channel: Molecular basis of K+ conduction and selectivity. Science 280: 69-77.

о Hille, B. 1992. Ionic Channels in Excitable Membranes, 2nd Ed. Sinauer Associates, Sunderland, MA, pp. 236-258, 423-444.

о Levinson, S. R. 1998. Structure and mechanism of voltage-gated ion channels. In N.Sperelakis (éd.),

Cell Physiology Source Book, 2nd Ed. Academic Press, San Diego, CA, pp. 406-428.

о McGehee, O.S., and Role, L.W. 1995. Physiological diversity of nicotinic acetylchnline receptors expressed by vertebrate neurons. Annu. Rev. Physiol. 57: 521-546.

о Miller, C. 1992. Hunting for the pore of voltage-gated channels. Curr. Biol. 2: 573-575.

о Unwin, N. 1993. Nicotinic acetylcholine receptor at resolution. J. Mol. Biol. 229: 1101-1124.

о Unwin, N. 1995. Acetylcholine receptor imaged in the open state. Nature 373: 37-43.

Цитированная литература

1.  Tank, D. W., et al. 1983. Proc. Nail. Acad. Sci. USA 80:5129-5133.

2.  Wise,  D. S., Schoenborn, B. P., and Karlin, A. 1981. J. Biol. Chem. 256: 4124-4126.

3.   Unwin, N.. Toyoshima, C., and Kubalek, E. 1988. J. Cell Biol. 107: 1123-1138.

4.  Toyoshima, C., and Unwin, N. 1988. Nature 336: 247-250.


Глава 3. Структура ионных каналов                                                    69

5.   Maeno, T., Edwards, С, and Anraku, M. 1977. У. Neurobiol. 8: 173-184.

6.   Dwyer, T. M., Adams, D.J., and Hille, В. 1980. У. Сет). Physiol. 75: 469-492.

7.   Raftery, M. Α., et al. 1980. Science 208: 1454-1457.

8.   Noda, M., et al. 1982. Nature 299: 793-797.

9.   Noda, M., et al. 1983. Nature 301: 251-255.

10.   Noda, M., et al. 1983. Nature 302: 528-532.

11.   McCrea, P. D., Popot, J-L., and Engleman, D. M. 1987. EMBO У. 6:3619-3626.

12.   DiPaola, M., Czajkowski, C., and Karlin, A. 1989. У. ВЫ. Chem. 264: 15457-15463.

13.   Miledi, R, Parker, I., and Sumikawa, K. 1983. Proc. R. Soc. Lond. В 218: 481-484.

14.  Takai, T., et al. 1985. Nature 315: 761-764.

15.   Mishina, M., et al. 1986. Nature 321: 406-411.

16.   Leonard, R. J., et al. 1988. Science 242: 1578-1581.

17.  Akabas, M. H., et al. 1994. Neuron 13: 919-927.

18.   Unwin, N. 1993. У. Mol. ВЫ. 229: 1101-1124.

19.   Unwin, N. 1995. Nature 373: 37-43.

20.  Wilson, G. G., and Karlin, A. 1998. Neuron 20: 1269-1281.

21.   Orteils, M. O., and Lunt, G. G. 1995. Trends Neu-rosci. 18: 121-127.

22.  Colquhoun, L. M., and Patrick, J.W. 1997. Adv. Pharmacol. 39: 191-220.

23.   McGehee, D. S., and Rôle, L. W. 1995. Annu. Rev. Physiol. 57: 521-546.

24.  Cooper, Ε., Couturier, S., and Ballivet, M. 1991. Nature 350: 235-238.

25.  Sieghart, W. 1995. Pharmacol. Rev. 47: 181-234.

26.   McKernan, R. M., and Whiting, P.J. 1996. Trends Neurosci. 19: 139-143.

27.   Bormann, J., and Feigenspan, A.  1995.  Trends Neurosci. 18: 515-519.

28.   Kuhse, J., Betz, H., and Kirsch, J. 1995. Cuir. Opin. Neurobiol. 5: 318-323.

29.  Yakel, J. L, and Jackson, M. B. 1988. Neuron 1: 615-621.

30.  Maricq, A.V., et al. 1991. Science 254: 432-437.

31.  Orteils, M. O., and Lunt, G. G. 1995. Trends Neurosci. 18: 121-127.

32.  Unwin, N. 1989. Neuron 3: 665-676.

33.   Miller, J., Agnew, W. S., and Levinson, S. R. 1983. Biochemistry 22: 462-470.

34.   Hartshorn, W. Α., and Catterall, W. A. 1984. У. Biol. Chem. 259: 1667-1675.

35.   Barchi, R. L. 1983. У. Neurochem. 40: 1377-1385.

36.  Noda, M., et al. 1984. Nature 312: 121-127.

37.  Cormick, Κ. Α., et al. 1998. У. Biol. Chem. 273: 3954-3962.

38.  Trimmer J. S., et al. 1989. Neuron 3: 33-49.

39.   Kallen, R.G., et al. 1990. Neuron 4: 233-342.

40.   Rogart, R. В., et al. 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 8170-8174.

41.   Hofmann, F., Biel, M., and Flockerzi, V. 1994. Annu. Rev. Neurosci. 17: 399-418.

42.   Randall, A., and Tsien, R. W. 1995. У. Neurosci. 15: 2995-3012.

43.  Tanabe, T., et al. 1987. Nature 328: 313-318.

44.   Walker, D., and De Waard, M. 1998. Trends Neurosci. 21: 148-154.

45.   Papazian, D. M., et al. 1987. Science 237: 749-753.

46.  Timpe, L. C., et al. 1988. Nature 331: 143-145.

47.   SalkofT,   L.,  et  al.   1992.   Trends Neurosci.   15: 161-166.

48.  Jan, L. Y., and Jan, Y. N. 1997. Annu. Rev. Neurosci. 20: 91-123.

49.   MacKinnon, R. 1991. Nature 350: 232-238.

50.   Yool, A. J., and Schwarz, T. L. 1991. Nature 349: 700-704.

51.  Yellen, G., et al. 1991. Science 251: 939-942.

52.   Miller, C. 1992. Cuir. Biol. 2: 573-575.

53.   Heinemann,   S. H.,   et  al.   1992.   Nature  356: 441-443.

54.   Doyle, D.A., et al. 1998. Science 280: 69-77.

55.   MacKinnon, R., et al. 1998. Science 280: 106-109.

56.   Mullins, L.J. 1975. Biophys. J. 15: 921-931.

57.   Liu, Y, et al. 1997. Neuron 19: 175-184.

58.  Jentsch, T. J., Steinmeyer, K., and Schwarz, G. 1990. Nature 348: 510-514.

59.  Jentsch, T.J., et al. 1995. У. Physiol. 482P: 19S-25S.

60.   Schmidt-Rose, Y., and Jentsch, T. J. 1997. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 7633-7638.

61Middleton, R.E., Pheasant, D.J., and Miller, C.

1996. Nature 383: 337-340.

62.   Doupnik, C.A., Davidson, N., and Lester, H. A. 1995. Cuir. Opin. Neurobiol. 5: 268-277.

63.   Nicholls, C. G., and Lopatin, A. N. 1997. Annu. Rev. Physiol. 59: 171-191.

64.   Burnstock, G. 1996. Drug Dev. Res. 39: 204-242.

65.   Burnstock, G. 1996. P2-Purinoceptors: Localization, Function and Transduction Mechanisms. Wiley, London.

66.   Soto, F., Garcie-Guzman, M., and Sturuner, W.

1997. У. Membr. Biol. 160: 91-100.

67.   Seeburg, P.H. 1993. Trends Neurosci. 16: 359-365.

68.   Moriyoshi, K., et al. 1991. Nature 354: 31-37.

69.   Keinân, K., et al. 1990. Science 249: 556-560.

70.   Egebjerg, J., et al. 1991. Nature 351: 745-748.

71.   Dani, J.A., and Mayer, M. I. 1995. Cuir. Opin. Neurobiol. 5: 310-317.

72.   Hollmann,   M.,   Maron,   C.,   and  Heinemann, S. 1994. Neuron 13: 1331-1343.

73.   Finn, J.T., Grunwald, M. E., and Yau, K-W. 1996. Annu. Rev. Physiol. 58: 395-426.

74.   Zagotta, W.N., and Siegelbaum, S.A. \996.Annu. Rev. Neurosci. 19: 235-263.

75.   Kôhler, M., et al. 1993. Neuron 10: 491-500.

76.   Kyte, J., and Doolittle, R. F. 1982. У. Mol. Biol. 157: 105-132.


Глава 4 Транспорт через мембрану клетки

Вход и выход ионов через каналы в мембране нейрона имеет пассивный характер и происходит благодаря наличию электрических и химических градиентов. Для компенсации результатов передвижения ионов клетка использует активные транспортные механизмы, которые затрачивают энергию на перемещение ионов в направлении, противоположном их электрохимическим потенциалам. Таким образом, концентрации ионов в цитоплазме поддерживаются на постоянном уровне, что позволяет сохранить неизменным потенциал покоя, а также генерировать электрические сигналы.

Первичный активный транспорт осуществляется за счет энергии гидролиза АТФ. Наиболее распространенный пример такого транспорта — натрий-калиевый обменник, или насос. Специальная молекула, называемая натрий-калиевой АТФазой, осуществляет за счет энергии расщепления одной молекулы АТФ перенос трех ионов натрия наружу и двух ионов калия внутрь клетки. Поскольку в результате каждого транспортного цикла происходит изменение суммарного трансмембранного заряда на единицу, натрий-калиевый насос является электрогенным, то есть производит электричество. Другой пример активного ионного транспорта — АТФазы, выводящие кальций из цитоплазмы: кальциевые АТФазы плазматической мембраны выкачивают кальций за пределы клетки, а АТФазы эндоплазматического и саркоплазматического ретикулумов закачивают кальций из цитоплазмы во внутриклеточные структуры.

Вторичный активный транспорт основан на энергии передвижения ионов натрия в направлении их электрохимического градиента. При этом другие ионы переносятся за счет движения ионов натрия либо в том же (ко-транспорт), либо в обратном направлении (ионообмен). Примером такого механизма является натрий-кальциевый обменник, выводящий один ион кальция за счет входа в клетку трех ионов натрия. Как и все системы активного транспорта, этот обменник обратим и может работать как в прямом, так и в обратном направлении, в зависимости от соотношения электрических и химических градиентов для обоих ионов. Вторая система натрий-кальциевого обмена встречается в клетках сетчатки и осуществляет перенос одного иона кальция и одного иона калия наружу, в обмен на четыре входящих иона натрия. Энергия входа натрия в клетку используется также для переноса ионов хлора и бикарбоната через клеточную мембрану. Все вышеперечисленные механизмы основаны на передвижении натрия в направлении его электрохимического градиента и, следовательно, зависят от эффективности работы натрий-калиевого насоса, обеспечивающего поддержание этого градиента.

Транспорт медиаторов необходим для функционирования нейронов. Накопление молекул медиатора в синаптических пузырьках (везикулах) в цитоплазме пресинаптического окончания невозможно без такого транспорта, основанного на перемещении ионов (ионно-сопряженный транспорт). Подобный же механизм используется для обратной закачки медиатора после его выброса в синаптическую щель.

На сегодняшний день выделен и клонирован целый ряд транспортных АТФаз и высказаны предположения об их конфигурации в клеточной мембране. Все АТФазы состоят из 10-12 трансмембранных сегментов, которые, по всей вероятности, образуют канало-подобные структуры. Передвижение веществ по этим каналам происходит в результате выдвижения участков, соответствующих местам связывания ионов, поочередно то во внеклеточную, то во внутриклеточную среды.


Глава 4. Транспорт через мембрану клетки                                              71

В главе 2 обсуждался механизм генерации электрических сигналов при перемещении ионов через каналы в плазматической мембране. Так, например, движение положительных ионов натрия внутрь клетки приводит к снижению суммарного негативного заряда на внутренней стороне мембраны, то есть приводит к ее деполяризации. Напротив, вход в клетку отрицательно заряженных ионов хлора влечет за собой гиперполяризацию. Движение ионов через каналы носит пассивный характер и обусловлено наличием электрических и концентрационных градиентов на мембране. При отсутствии компенсирующих процессов такое передвижение ионов очень скоро привело бы к полному исчезновению электрохимических градиентов.

Существует, однако, целый ряд механизмов активного транспорта, которые перемещают ионы в направлении, противоположном электрохимическому градиенту. Эти механизмы компенсируют утечку ионов, происходящую как в покое, так и в результате электрической активности. Активный транспорт подразделяется на первичный и вторичный. Первичный транспорт происходит за счет прямого использования метаболической энергии, а именно, энергии расщепления АТФ. Вторичный активный транспорт использует энергию потока ионов (чаще всего ионов натрия) в направлении их электрохимического градиента для перемещения других ионов через мембрану либо в том же (ко-транспорт), либо в противоположном направлении (ионообмен).

§1. Натрий-калиевый обменный насос

Большинство возбудимых клеток имеют потенциал покоя от -90 до -60 мВ. Равновесный потенциал для ионов натрия (ENa) — обычно порядка +50 мВ. Таким образом, существует большой электрохимический потенциал, стремящийся перенести ионы натрия внутрь клетки. Такой перенос осуществляется при помощи многочисленных механизмов. Кроме того, равновесный потенциал для калия более отрицателен, чем потенциал покоя, вследствие чего ионы калия постоянно выводятся из клетки. Для поддержания жизнеспособности клетки необходимо, чтобы ионы натрия непрерывно переносились наружу, а ионы калия внутрь клетки, т, е. против их электрохимических градиентов. Для этой цели в мембране клетки существует натрий-калиевый обменный насос, который при каждом своем цикле переносит три иона натрия наружу и два иона калия внутрь клетки.

Уже ранние эксперименты Ходжкина и Кейнеса 1, 2) на гигантском аксоне кальмара убедительно показали, что источником энергии для этого процесса является расщепление АТФ. В то же время Скау3) продемонстрировал, что АТФаза, изолированная из нерва краба, обладает многими из биохимических характеристик, которые должен иметь натрий--калиевый насос. Действительно, как для работы насоса, так и для активации АТФазы необходимо присутствие ионов натрия и калия. Кроме того, уабаин (ouabain) одинаково блокирует активность насоса и АТФазы.

На основе этих наблюдений был сделан вывод о том, что натрий-калиевая АТФаза и есть натрий-калиевый насос. Она принадлежит к семейству АТФаз Р-типа (P-type), получившему свое название потому, что в процессе работы эти АТФазы образуют фосфорилированную форму. Перенос ионов осуществляется за счет энергии расщепления АТФ. К этому же семейству относятся кальциевые АТФазы, выводящие ионы кальция из цитоплазмы клетки, и протон-калиевые АТФазы, наиболее примечательная функция которых заключается в секреции большого количества кислоты в полость желудка.

Биохимические свойства натрий-калиевой АТФазы

Биохимические свойства натрий-калиевой АТФазы хорошо известны уже на протяжении многих лет4). Стехиометрическое соотношение связываемых катионов совпадает со свойствами транспортного процесса: в среднем, на каждую расщепляемую молекулу АТФ переносится три иона натрия и два иона калия. Избирательность к ионам калия весьма высока: это единственный субстрат, переносимый насосом наружу клетки, и единственный моновалентный катион, не принимаемый насосом для переноса внутрь. Например, литий, аммоний, рубидий, цезий и таллий могут заменить калий во внеклеточном растворе, но не натрий во внутриклеточном. В отсутствии калия насос переносит натрий гораздо менее эффективно (около 10% мощности).

Специфическим блокатором натрий-калиевой транспортной системы являются вещества, используемые при лечении сердечной


72                                       Раздел II. Передача информации в нервной системе

недостаточности (digitalis glycosides), в особенности уабаин и строфантидин. Блокируя активный транспорт натрия и калия, эти вещества не оказывают воздействия на пассивное перемещение ионов через ионные каналы в мембране.

Экспериментальные доказательства электрогенности насоса

В результате того, что насос переносит за один цикл неодинаковое количество ионов натрия и калия, происходит суммарный перенос через мембрану одного положительного заряда. Поэтому насос называется электрогенным. Это свойство насоса было протестировано экспериментально на аксоне кальмара 1· 2· 5), а также Томасом на нейронах улитки 6, 7). Нейроны улитки достаточно велики для того, чтобы можно было ввести несколько микроэлектродов в цитоплазму, не повреждая клетки. Для исследования взаимосвязи между внутриклеточной концентрацией натрия, током через насос и мембранным потенциалом Томас использовал две микропипетки для введения ионов в клетку, одна из которых была заполнена ацетатом натрия, а другая ацетатом лития (рис. 4.1 А). Третья пипетка использовалась в качестве электрода для регистрации мембранного потенциала. Четвертая пипетка служила токовым электродом, обеспечивающим режим фиксации потенциала (voltage--clamp; глава 6). Еще один электрод, сделанный из натрий-чувствительного стекла, позволял измерять внутриклеточную концентрацию натрия. Для инъекции натрия, на электрод, заполненный ионами натрия, подавалось положительное напряжение по отношению к электроду, содержащему ионы лития. Таким образом, весь ток в инъекционной системе протекал между двумя пипетками внутри клетки, а не через клеточную мембрану.

Результат опыта показан на рис. 4.1 В. После кратковременной инъекции работа насоса активизировалась и мембрана клетки гиперполяризовалась приблизительно на 20 мВ. По мере того, как избыточное количество натрия выводилось из клетки, мембранный потенциал постепенно восстанавливался, что занимало несколько минут. Инъекция лития, произведенная посредством приложения положительного потенциала к литиевой пипетке, не привела к гиперполяризации клетки.

Можно выделить несколько фактов, подтверждающих участие насоса в изменении мембранного потенциала. Так, в присутствии блокатора транспорта (уабаина) гиперполяризация мембраны была значительно менее выраженной или полностью устранялась (рис. 4.1C). Кроме того, устранение калия из внеклеточного раствора приводило к исчезновению влияния инъекции натрия на мембранный потенциал; восстановление уровня внеклеточного калия после инъекции натрия вызывало немедленную гиперполяризацию (рис. 4.1 D).

Количественные оценки скорости работы насоса и соотношения обмениваемых ионов были получены в опытах с фиксацией потенциала. Этот метод (описанный в главе 6) позволяет измерять ток, протекающий через мембрану, в то время как мембранный потенциал поддерживается на неизменном уровне. Концентрация натрия также измерялась в ходе этого опыта. Инъекция натрия вызвала кратковременное повышение его внутриклеточной концентрации, которое сопровождалось выходящим током. Длительность и амплитуда этого выходящего тока зависели от изменения концентрации натрия внутри клетки (рис.4.1E). Величина суммарного заряда, перенесенного наружу клетки, была подсчитана на основании измерения интеграла мембранного тока (то есть площади под кривой тока). Суммарный заряд составил приблизительно одну треть заряда ионов натрия, инъецированных в клетку. Эти данные подтверждают представление о том, что на каждые три иона натрия, выводимого насосом из клетки, приходится два иона калия, переносимые внутрь.

Механизм переноса ионов

Рис. 4.2 иллюстрирует последовательность событий, лежащих в основе переноса ионов натрий-калиевым насосом. Внутри канало-подобной структуры насоса расположены места связывания калия и натрия, которые поочередно вступают в контакт с внутриклеточной и внеклеточной средами. Циклическое изменение конформации насоса происходит за счет фосфорилирования и дефосфорилирования его белковой молекулы. Этот процесс сопровождается изменением сродства мест связывания к соответствующим ионам. Места связывания, направленные внутрь клетки, имеют низкое сродство к калию и высокое к натрию (рис. 4.2А). Связывание трех ионов натрия ведет к изменению конформации белка, последующему связыванию АТФ и фосфорилированию фермента (рис. 4.2В).


Глава 4. Транспорт через мембрану клетки                                         73

Рис. 4.1. Влияние инъекции натрия в нейрон улитки на внутриклеточную концентрацию натрия, мембранный потенциал и ток через мембрану. (А) Два микрозлектрода используются для инъекции натрия или лития. Натрий-чувствительный электрод измеряет концентрацию натрия внутри клетки. Еще один электрод используется либо для измерения мембранного потенциала, либо, в паре с токовым электродом, для фиксации потенциала на определенном уровне с целью измерения тока через мембрану (показан на рис. 4.1Е)   (В) Гиперполяризация мембраны вследствие инъекции натрия. (Небольшие кратковременные выбросы на кривой представляют собой спонтанные потенциалы действия, размер которых преуменьшен за счет инертности самописца.) Инъекция лития не влечет за собой гиперполяризации. (С) После подачи блокатора натриевых насосов уабаина (20 г/мл) инъекция натрил вызывает значительно менее выраженную гиперполяризацию. (D) Удаление калия из внеклеточной среды блокирует насос, поэтому инъекция натрия не вызывает гиперполяризации до тех пор, пока уровень калия не восстанавливается. (Е) Измерение мембранного тока при потенциале, фиксированном на —47 мВ В результате инъекции натрия его внутриклеточная концентрация повышается, и через мембрану протекает выходящий ток. Выбросы на кривой натриевой концентрации представляют собой артефакты инъекционной системы; временной ход изменений этой концентрации показан пунктиром.

Fig. 4.1. Effects of Sodium Injection into a snail neuron on intracellular sodium concentration, membrane potential, and membrane current. (A) Two micropipettes are used to inject either sodium or lithium. A sodium-sensitive electrode measures the intracellular sodium concentration. Another electrode measures membrane potential or, alternatively, is used in combination with a current-passing electrode to hold the membrane potential steady while measuring membrane current (shown in E). (B) Hyperpolar-ization of the membrane following intracellular injection of sodium. (The small rapid deflections are spontaneously occurring action potentials, reduced in size because of the poor frequency response of the pen recorder.) Injection of lithium does not produce hyperpolarization. (C) After application of ouabain (20 g/ml), which blocks the sodium pump, hyperpolarization by sodium injection is greatly reduced. (D) Removal of potassium from the extracellular solution blocks the pump, so sodium injection produces no hyperpolarization until potassium is restored. (E) Measurements of membrane current with the membrane potential clamped at -47 mV. Sodium injection results in an increase in intracellular sodium concentration, and an outward current across the cell membrane. Sharp deflections on the sodium concentration record are artifacts from the injection system; the time course of the concentration change is indicated by the dashed line. (After Thomas, 1969.)

Фосфорилирование приводит к дальнейшему изменению конформации, в результате которого места связывания ионов оказываются

в контакте с внеклеточной средой (рис.4.2С). В этом положении места связывания обладают низким сродством к натрию и вы-


74                                       Раздел II. Передача информации в нервной системе

Рис. 4.2. Перенос ионов Na-K АТФазой. (А)   Посадочные  места, направленные внутрь клетки, обладают высоким сродством к натрию и низким — к калию. Ионы калия, до этого момента связанные с молекулой АТФазы, высвобождаются, в то время как ионы натрия связываются с ней. (В) Вслед за связыванием натрия происходит связывание молекулы АТФ и фосфорилирование фермента. (С) В результате фосфорилирования в структуре фермента происходят изменения, приводящие к выдвижению посадочных мест во внеклеточную среду. (D) В таком положении посадочные места обладают низким сродством к натрию и высоким — к калию, поэтому они связывают два иона калия. (Е) При связывании калия АТФаза дефосфори-лируется. (Е) Возврат в первоначальное состояние.

Fig. 4.2. Ion Translocation by Na-K ATPase. (A) Inward-facing binding sites have a high affinity for sodium and a low affinity for potassium. Previously bound potassium ions are released and three sodium ions are bound. (B) Sodium binding is followed by ATP binding and phosphorylation of the enzyme. (C) The phosphorylated enzyme undergoes a conformational change such that its binding sites face the extracellular solution. (0) Outward-facing sites have a low affinity for sodium and high affinity for potassium, and they bind two potassium ions. (E) Potassium binding leads to dephosphorylation. (F) Dephosphorylation is followed by a return to the starting conformation.

соким к калию, поэтому ионы калия замещают два иона натрия (рис. 4.2D). Связывание калия вызывает дефосфорилирование фермента (рис. 4.2Е) и возвращает насос в первоначальное положение (рис. 4.2F). Ионы калия высвобождаются во внутриклеточное пространство.

§ 2. Кальциевые насосы

Изменение концентрации ионов кальция внутри клетки играет важнейшую роль во многих процессах жизнедеятельности нейронов, таких как высвобождение медиатора в синаптическую щель, активация ионных каналов в клеточной мембране, а также регуляция целого ряда цитоплазматических ферментов.

В мышечных клетках кальций играет ключевую роль в запуске процесса сокращения мышечного волокна. Все эти функции связаны с кратковременным повышением концентрации кальция в цитоплазме, поэтому важной задачей для клетки является поддержание неизменного уровня кальция в покое. В противном случае различные кальций--зависимые механизмы будут активироваться не в ответ на специфическое раздражение, а постоянно.

Изменение концентрации кальция в цитоплазме может происходить по двум причинам: кальций может входить или выходить через клеточную мембрану, либо переходить из цитоплазмы во внутриклеточные органеллы и обратно (рис. 4.3) 8), в первую очередь в эндоплазматический ретикулум


Глава 4. Транспорт через мембрану клетки                                                 75

Рис. 4.3. Внутриклеточные органеллы. В цитоплазме клетки находится множество внутриклеточных огранелл. Некоторый из них — в первую очередь эндо- и саркоплаэматиче ский ретикулумы — способны запасать кальций.

Fig. 4.3. Intracellular   Compartments.   Within the  cytoplasm  of animal cells  are   numerous intracellular compartments. Some of these compartments — principally the endoplasmic  reticulum   and   mitochondria — sequester calcium.

(в мышце — саркоплазматический ретикулум) и митохондрии 9). Для измерения внутриклеточной концентрации кальция в клетку вводятся специальные вещества, такие как экворин 10) (aequorin) или фура-2 11) (fura2), которые излучают или поглощают свет при связывании ионизированного кальция. Другой способ отслеживания изменений уровня кальция — трансфекция особых белковых комплексов 12, 13), созданных при помощи генной инженерии таким образом, что их флуоресцентные свойства изменяются в зависимости от концентрации ионизированного кальция. В обоих случаях изменения в поглощении или излучении, пропорциональные изменениям уровня кальция, измеряются с помощью высокочувствительных оптических методов. Средняя концентрация кальция в покое для большинства нейронов составляет от 10 до 100 нМ. Уровень кальция в межклеточном пространстве позвоночных составляет от 2 до 5 ммоль.

Для поддержания низкой внутриклеточной концентрации кальция необходим механизм, осуществляющий непрерывный вывод кальция из клетки вопреки наличию значительного концентрационного градиента. Кроме того, системы кальциевого транспорта через внутриклеточные мембраны поддерживают высокую концентрацию кальция в органеллах. Так, уровень кальция в эндоплазматическом ретикулуме может достигать 400 мкмоль12, 14), а в саркоплазматическом ретикулуме мышцы поднимается до 10 ммоль 15). Молекула, ответственная за транспорт кальция через плазматическую и цитоплазматическую мембраны, называется кальциевая АТФаза. Еще один механизм транспорта кальция будет обсуждаться ниже в этой главе.

АТФазы зндоплазматического и саркоплазматического ретикулумов

Одно из семейств АТФаз расположено в мембране эндоплазматического ретикулума нейронов, а также в саркоплазматической мембране скелетной мышцы. Эти АТФазы переносят ионы кальция из цитоплазмы во внутриклеточные органеллы. Сокращение мышечного волокна происходит при освобождении кальция из саркоплазматического ретикулума в миоплазму. Быстрое устранение ионов кальция из миоплазмы, необходимое для релаксации мышцы, обеспечивается за счет высокой концентрации АТФаз в мембране саркоплазматического ретикулума.

Кальциевый транспортный цикл в принципе аналогичен циклу работы натрий-калиевого насоса, показанному на рис. 4.2. Он начинается с присоединения двух ионов кальция к местам связывания, расположенным в цитоплазме и обладающим высоким сродством к кальцию (Km(Ca) ~ 100 нМ) 16).


76                                      Раздел II. Передача информации в нервной системе

Затем происходит фосфорилирование фермента и изменение его конформации, в результате чего ионы кальция переносятся внутрь ретикулума. После освобождения кальция молекула АТФазы дефосфорилируется и возвращается в свое первоначальное состояние.

АТФазы плазматической мембраны

Кальциевые АТФазы встречаются также в плазматической мембране любой клетки. За исключением некоторых деталей 17), строение и функция этих АТФаз не отличается от кальциевых АТФаз эндоплазматического и саркоплазматического ретикулумов. Внутриклеточное место связывания обладает высоким сродством к кальцию 18), однако во время транспортного цикла происходит связывание всего одного иона кальция. Концентрация АТФаз в плазматической мембране нейронов и мышечных клеток довольно низка, поэтому эффективность этой транспортной системы не слишком высока. Тем не менее, с задачей устранения входящего в клетку кальция она справляется.

§3. Натрий-кальциевый обменник

Во многих механизмах ионного транспорта используется совершенно иной принцип переноса ионов через мембрану против электрохимического градиента. Вместо энергии расщепленной молекулы АТФ эти механизмы используют энергию уже существующего перемещения ионов натрия в направлении их концентрационного градиента, то есть внутрь клетки. Один из примеров — натрий-протоновый обменник, переносящий ионы в соотношении 1 : 1 и участвующий в поддержании внутриклеточного рН. Протоны переносятся из клетки наружу вопреки электрохимическому градиенту в обмен на ионы натрия, перемещаемые внутрь клетки. Подобным же образом переносятся кальций, калий, бикарбонат и хлор. В результате работы этих вторичных транспортных механизмов, в состоянии покоя внутрь клетки попадает значительное количество натрия. Тем более важна роль натрий-калиевых обменников, выводящих натрий обратно во внеклеточную среду. В некоторых случаях механизмами вторичного активного транспорта используется энергия перемещения ионов калия в направлении их электрохимического градиента.

Транспортные системы натрий-кальциевого обмена

Существуют по-крайней мере два механизма натрий-кальциевого обмена. Наиболее часто встречаются обменники типа NCX (Na—Са exchange), которые были впервые описаны в сердечной мышце 19), нерве краба 20) и аксоне кальмара 21). При переносе транспортной молекулой одного иона кальция наружу происходит перенос трех ионов натрия внутрь клетки 22). Несмотря на то, что сродство NCX к кальцию ниже, чем у кальциевой АТФазы, общая мощность этого транспортного механизма выше приблизительно в 50 раз, поскольку плотность таких молекул в мембране значительно выше 23, 24). NCX играют важную роль в условиях повышенного входа кальция в клетку, вызванного электрической активностью и превышающего возможности АТФаз по устранению избыточного кальция из клетки.

На рис. 4.4 показан принцип действия механизма натрий-кальциевого обмена в аксоне кальмара. Для измерения внутриклеточной концентрации кальция использовали флуоресцентную молекулу экворин (aequorin). В состоянии покоя вход кальция в направлении электрохимического градиента уравновешивается за счет переноса ионов из клетки ионным обменником (рис. 4.4А). В начале опыта внутриклеточная концентрация кальция высока потому, что уровень кальция снаружи аксона повышен (112 ммоль). При снижении внеклеточной концентрации снижается и пассивный вход кальция в аксон. В результате снижается внутриклеточная концентрация кальция, и движущая сила для этого иона возрастает до тех пор, пока скорость пассивного втока вновь не сравняется со скоростью выброса кальция. С другой стороны, снижение внеклеточной концентрации натрия приводит к увеличению внутриклеточной концентрации кальция, поскольку обменник медленнее выводит кальций в условиях сниженной движущей силы для натрия. Поэтому происходит повышение внутриклеточного уровня кальция, снижающее скорость входа кальция в клетку. Замена ионов кальция ионами лития, не способными участвовать в работе обменника, приводит к дальнейшему повышению внутриклеточной концентрации кальция.


Глава 4. Транспорт через мембрану клетки                                                 77

Рис. 4.4. Транспорт   ионов    кальция из аксона кальмара наружу. (А) Схема натрий-кальциевого обменника. Выброс одного иона кальция из клетки энергетически сопряжен с входом трех ионов натрия в направлении их электрохимического  градиента.  Равновесная концентрация кальция устанавливается в тот момент, когда вывод кальция обменником из клетки уравновешивает пассивный вход кальция в клетку. (В) Влияние изменений внеклеточных концентраций  кальция и натрия на внутриклеточный уровень кальция. Концентрация кальция внутри клетки измеряется фотодетектором по уровню свечения зкварина (aequorin), инъецированного в клетку. Снижение внеклеточной  концентрации  кальция с  112 до 11 ммоль влечет за собой снижение его внутриклеточного уровня. Ионы лития не способны заменить натрий в зтой транспортной системе.

Fig. 4.4. Transport of Calcium Ions out of a squid axon. (A) Scheme for sodiumcalcium exchange. The influx of three sodium ions down their electrochemical gradient is coupled to the extrusion of one calcium ion. The calcium concentration reaches a steady state when outward transport through the exchanger is equal to the inward Ca2+  leak. (B) Effect of changes in extracellular calcium and sodium on intracellular cal-

cium concentration. Changes in intracellular calcium concentration are measured by changes in the luminescence of injected aequorin, indicated by nanoamperes of current from the photodetector. Increased readings mean increased concentrations of intracellular free calcium. Reducing the extracellular calcium concentration from 112 mM) to 11 mM) reduces the intracellular concentration. Reducing extracellular sodium reduces outward calcium transport and hence increases intracellular concentration. Lithium ions do not substitute for sodium in the transport system. (From Baker, Hodgkin, and Ridgetvay, 1971.)

Реверсия направления работы NCX

Изменение градиентов для одного или нескольких ионов, участвующих в работе обменника, может привести к перемене направления его работы. Интересно, что в случае NCX такая смена направления может произойти в физиологических условиях. При этом кальций будет переноситься внутрь клетки, а натрий — выводиться из нее. Направление работы NCX определяется разницей между энергией, выделяемой при перемещении трех ионов натрия внутрь клетки, и энергией, необходимой для переноса одного иона кальция наружу. Одним из факторов, определяющих этот энергетический баланс, является мембранный потенциал. Влияние потенциала мембраны обусловлено тем, что процесс ионообмена не является электрически нейтральным. Вследствие каждого прямого цикла работы обменника, через мембрану внутрь клетки переносится один положительный заряд. Следовательно, гиперполяризация мембраны облегчает прямой цикл обменника, в то время как деполяризация его затрудняет и может привести к изменению направления, то есть к работе обменника в режиме обратного цикла. Следует подчеркнуть, что, несмотря на отсутствие электрической нейтральности, обменники не являются электрогенными. В отличие от насосов, они работают за счет электрохимических градиентов, а не производят их.

Энергия, выделяемая за счет входа ионов натрия в клетку (или энергия, необходимая для переноса этих ионов наружу), равна про-


78                                       Раздел II. Передача информации в нервной системе

изведению заряда на разность между равновесным потенциалом для натрия (ENa) и мембранным потенциалом (Vm). Для трех ионов натрия эта энергия будет равна 3(.ENa Vm). Соответственно, для одного двухвалентного иона кальция энергия переноса будет равна 2(ЕСаVm). При определенном значении мембранного потенциала уровни энергии сравняются и перенос прекратится. Обозначив это значение через потенциал реверсии Vr, получим

или

При значениях потенциала более отрицательных, чем потенциал реверсии, натрий перемещается внутрь клетки, а кальций — наружу. При более положительных значениях направление движения ионов сменяется на обратное.

Предположим, что концентрации натрия и кальция в клетке принимают значения 15 ммоль и 100 нМ соответственно, а во внеклеточной среде находится 150 ммоль натрия и 2 ммоль кальция. Такие значения вполне вероятны для клеток млекопитающих. По уравнению Нернста (глава 2), равновесный потенциал для натрия будет +58 мВ, а для кальция +124 мВ. Потенциал реверсии, при котором движение ионов через обменник прекратится, будет —74 мВ. Это значение близко к потенциалу покоя многих клеток млекопитающих. Следовательно, в отдельно взятой клетке направление ионообмена может быть как прямым, так и обратным, в зависимости от текущего значения мембранного потенциала и от того, происходило ли накопление ионов натрия или кальция в этой клетке. В клетках сердечной мышцы вход кальция через NCX в ходе потенциала действия способен вызвать сокращение мышцы 25, 26), а его последующий вывод из клетки посредством того же NCX способствует релаксации 27).

Натрий-кальциевый обменник в палочках сетчатки

Для клеток с низкими значениями потенциала покоя NCX не представляется надежной системой вывода кальция из цитоплазмы. В таких клетках кальций сначала будет накапливаться до некоторого, достаточно высокого, уровня. Примером такой клетки может служить палочка сетчатки млекопитающих, мембранный потенциал покоя которой обычно находится на уровне -40 мВ (глава 19). В мембране таких клеток встречается другой тип натрий-кальциевого обменника, RetX 28) - 30). По сравнению с NCX дополнительная энергия для переноса кальция получается за счет двух отличий в стехиометрии RetX. Во-первых, вместо трех ионов натрия через RetX проходят четыре. Во-вторых, в работе обменника участвует ион калия, также перемещающийся в направлении своего электрохимического градиента и, следовательно, выделяющий при этом дополнительную энергию. Уравнение потенциала реверсии натрий--калий-кальциевого обменника имеет следующий вид:

Исходя из подсчитанных выше значений ЕNa и ECa и принимая значение ЕK за —90 мВ, получим из уравнения Нернста Vr. = +74 мВ. Очевидно, что вероятность реверсии ионообмена через RetX весьма мала.

Для лучшего понимания работы RetX представляется целесообразным задать следующий вопрос: какое значение должен принять равновесный потенциал ЕCa для того, чтобы Vr сравнялся с потенциалом покоя клетки, т. е. -40 мВ. С помощью того же уравнения получим 181 мВ, что при внеклеточной концентрации кальция 2 ммоль дает значение внутриклеточной концентрации 1 нМ. Другими словами, при мембранном потенциале -40 мВ обменник RetX обладает достаточной энергией для того, чтобы снизить уровень кальция внутри клетки до 1 нМ. Интересно отметить, что при тех же условиях NCX способен понизить внутриклеточную концентрацию кальция только до 383 нМ.

§ 4. Хлорный транспорт

Концентрация хлора внутри клетки поддерживается в строго определенных границах. В нейронах постоянство уровня хлора особенно важно, поскольку от этого фактора зависит синаптическая депрессия (ингибирование) (глава 9). Хлор-чувствительные АТФазы были описаны в клетках мозга, выращенных в культуре 31), что указывает на возможность существования первичных механизмов транспорта хлора. Тем не менее, большая часть хлора переносится через мембрану посредством трех механизмов вторичного транспорта. Это — хлор-бикарбонатный обменник, выводящий ионы хлора из клетки через плазматическую мембрану; ко-транспорт калия


Глава 4. Транспорт через мембрану клетки                                           79

Рис. 4.5. Механизмы хлорного транспорта. (А) Хлор бикарбонатныи обменных, совместно с натрий-водородным обменником, определяет уровень рМ внутри клетки. (В) Калий-хлорный ко-транспорт осуществляет вывод ионов хлора из клетки за счет энергии выходящего тока калия в направлении его электрохимического градиента. (С) В некоторых нейронах транспорт хлора внутрь клетки производится сразу двумя независимыми механизмами, использующими натриевый электрохимический градиент. Первый — натрий-хлорный ко-транспортер, второй — натрий-калий-хлорный ко-транспортер, обладающий стехиометрией 1:1:2. Заметим, что все системы транспорта хлора электрически нейтральны.

Fig. 4.5. Mechanisms of Chloride Transport. (A) Chloride- bicarbonate exchange operates in parallel with sodium--hydrogen exchange to regulate intracellular pH. (B) Potassium-chloride cotransport uses the outward electrochemical gradient for potassium to transport chloride out of the cell. (C) In some neurons, inward chloride transport is mediated by two independent mechanisms, both using the electrochemical gradient for sodium. One is sodium--chloride cotransport the other sodium-potassium-chloride cotransport with a stoichiometry of 1 : 1 : 2. Note that all the chloride transport systems are electrically neutral.

и хлора наружу клетки; ко-транспорт натрия, калия и хлора. Эти механизмы представлены на рис. 4.5.

Хлор-бикарбонатный обменник

Хлор-бикарбонатный обменник (рис. 4.5А) встречается в большинстве клеток. Поскольку бикарбонат играет важную роль буфера ионов водорода в цитоплазме, этот механизм, наряду с натрий-водородным обменником, участвует в поддержании внутриклеточного рН. Томас 32) проводил эксперименты по измерению рН в нейронах улитки с помощью рН--чувствителъных электродов. Внутриклеточная среда закислялась посредством инъекции НС1 или аппликации СО2, после чего измерялась скорость восстановления уровня до первоначального. Восстановление замедлялось, если внеклеточный уровень бикарбоната был понижен, а также если внутриклеточная концентрация хлора была снижена. Более того, восстановления рН не происходило вовсе, если из внеклеточной среды полностью удалялся натрий. Следовательно, в процессе восстановления рН происходит перемещение ионов натрия и бикарбоната внутрь клетки в обмен на вывод ионов хлора наружу. Механизм блокируется веществами SITS и DIDS. Хлор и бикарбонат перемещаются против своих электрохимических градиентов за счет энергии, выделяемой при пассивном движении ионов натрия в направлении его градиента.

Калий-хлорный ко-транспорт

Еще одним механизмом переноса хлора является калий-хлорный ко-транспорт (рис. 4.5В) 33). Система не чувствительна к SITS и DIDS, но блокируется фуросемидом и буметанидом (furosemide, bumetanide). Это вещества блокируют хлорный транспорт в таких клетках, как трубчатые клетки почек. Энергия для переноса хлора поступает исключительно от движения ионов калия в направлении его электрохимического градиента, поскольку система эта нечувствительна к изменениям внеклеточной концентрации натрия.

Транспорт хлора внутрь клетки

В клетках многих типов, например, в волокнах скелетной мышцы, трубчатых клетках почки, аксоне кальмара, происходит активное накопление ионов хлора. Транспорт хлора внутрь клетки зависит от внеклеточных уровней калия и натрия, не чувствителен к DIDS и блокируется фуросемидом и буметанидом (furosemide, bumetanide). В клетках почки имеется два подтипа этого механизма: первый имеет стехиометрию Na : К : Cl


80                                       Раздел II. Передача информации в нервной системе

Рис. 4.6. Транспорт  медиаторов  (трансмиттеров)  в  синаптические пузырьки. Водородные АТФазы переносят протоны из цитоплазмы внутрь везикул, создавая тем самым электрохимический градиент для выхода протонов. Через молекулу вторичного посредника выходящий поток протонов предоставляет энергию для аккумуляции трансмиттера (Т) в пузырьках. Предполагается, что стехиометрия системы в случае транспорта моноаминов и ацетилхолина составляет 2 : 1 (А), глицина, ГАМК и глутамата — 1: 1 (В и С). Вместе с глутаматом в везикулу входит хлор.

Fig. 4.6. Transport of Neurotransmitters into Synaptic Vesicles. Hydrogen ATPase transports protons into the vesicle from the cytoplasm, creating an electrochemical gradient for proton efflux. Proton efflux through the secondary transport molecule provides the energy for accumulation of the neurotransmitter (T) in the vesicle. The proposed stoichiometry is 2 : 1 for monoamine and ACh transport (A), 1 : 1 for glycine, GABA, and glutamate transport (B and C). Glutamate transport is accompanied by chloride entry into the vesicle.

в соотношении 1 : 1 : 2, а второй Na : Cl в соотношении 1 : 1 (рис. 4.5С) 34). В экспериментах на аксоне кальмара Рассел 35, 36) показал существование натрий- и калий-зависимого транспорта хлора внутрь клетки, обладающего стехиометрией Na : К : Cl в соотношении 1:2:3. Пока неясно, объясняется ли это наличием третьего механизма хлорного транспорта или лишь одновременной работой двух вышеописанных механизмов. Транспорт хлора внутрь клетки был также описан в клетках спинного мозга головастиков 37).

§ 5. Транспорт нейромедиаторов

Помимо транспорта неорганических ионов, в нервных клетках имеются также механизмы накопления веществ, участвующих в синаптической передаче. Нейромедиаторы транспортируются в органеллы, находящиеся в цитоплазме пресинаптического нервного окончания, где и запасаются к моменту высвобождения в синаптическую щель. После высвобождения, такие медиаторы, как норэпинефрин, серотонин, ГАМК, глицин или глутамат, откачиваются из синаптической щели специальными переносчиками, расположенными в клеточной мембране самих нейронов или соседних глиальных клеток (главы 8 и 13). Все эти механизмы являются вторичными транспортными системами и черпают энергию из перемещения ионов калия, натрия или водорода в направлении их электрохимических градиентов.

Транспорт в синаптические пузырьки

Нейромедиаторы синтезируются в цитоплазме нервного окончания, после чего накапливаются в синаптических пузырьках (везикулах) при помощи механизма вторичного активного транспорта, сопряженного с выходом протонов. Этот механизм аналогичен вторичному транспорту через плазматическую мембрану, основанному на движении ионов натрия, однако вместо натриевого градиента здесь используется градиент протонов, создаваемый протонной АТФазой, переносящей протоны из цитоплазмы в синаптические пузырьки 38) - 40). Количество систем транспорта, основанных на энергии движения протонов, ограничено. Так, механизм везикулярного транспорта моноаминов обеспечивает накопление норэпинефрина, дофамина, гистамина и серотонина (5-НТ). Существует также обшая транспортная система для ГАМК и глицина. Ацетилхолин и глутамат обладают собственными системами закачки в пузырьки. Предполагаемая стехиометрия систем закачки показана на рис. 4.6. Все эти системы, не будучи электрически нейтральными, зависят от потенциала везикулярной мембраны и от градиента рН. Отличительная особенность механизма транспорта глутамата состо-


Глава 4. Транспорт через мембрану клетки                                                 81

 

Рис. 4.7. Закачка нейромедиаторов из внеклеточного пространства. (А) Закачка глутамата сопряжена с входом двух ионов хлора и выходом одного иона калия, кроме того, она сопровождается выбросом из клетки одного иона ОН   (или НС03). (В) В системах закачки ГАМК, глицина и моноаминов  (норэпинефрин, дофамин и серотонин) закачка трансмиттера (Т) сопряжена с входом двух ионов натрия и сопровождается входом одного иона хлора. Продукт гидролиза ацетилхолина, холин, закачивается в нервное окончание с той же стехиометрией, что и ГАМК, глицин и моноамины.

Fig. 4.7. Uptake of Neurotransmitters. (A) Glutamate uptake is coupled to the influx of two sodium ions and efflux of one potassium ion, and it is accompanied by the extrusion of one OH (or one HCO3 ) ion. (B) In the GABA, glycine, and monoamine (norepinephrine, dopamine, and serotonin) uptake systems, recovery of the transmitter (T) is coupled to the influx of two sodium ions and accompanied by the uptake of a single chloride ion. Choline from the hydrolysis of acetylcholine is recovered into the nerve terminal with the same stoichiometry as the GABA, glycine, and monoamine systems.

 

ит в том, что одновременно с медиатором внутрь пузырьков переносятся ионы хлора 41).

Механизм закачки медиатора в клетку

Медиаторы могут также закачиваться из внеклеточного пространства внутрь нейронов или глиальных клеток (главы 8 и 13). В целом этот процесс выполняет две задачи: 1) устранение медиатора из внеклеточного пространства, окружающего синапс, с целью прекращения его действия на постсинаптическую клетку 42, 43); и 2) закачку медиатора обратно в пресинаптическое окончание для повторного использования в синаптической передаче. Все подобные механизмы используют электрохимический градиент натрия для перемещения медиатора в цитоплазму.

На рис. 4.7 показаны два основных типа систем закачки медиатора 44). Механизмы первого типа сопряжены с перемещением ионов натрия внутрь и ионов калия наружу клетки. Такие системы используются для закачки нейтральных и кислых аминокислот, таких как глутамат45). Перемещение одной молекулы глутамата внутрь клетки сопряжено с перемещением двух или трех ионов натрия внутрь и одного иона калия наружу. Кроме того, происходит перемещение либо протона внутрь, либо гидроксильной группы наружу, что приводит к окислению внутриклеточной среды 46, 47).

Механизмы второго типа используют вход натрия для введения в клетку молекул медиатора и ионов хлора. Эти системы обеспечивают транспорт ГАМК, норэпинефрина, дофамина, глицина и серотонина в клетку. За один цикл в клетку входит один или два иона натрия, одна молекула медиатора и один ион хлора48).

Интересным свойством таких механизмов закачки медиаторов в клетку является отсутствие электрической нейтральности. Следовательно, вариации мембранного потенциала, даже в физиологическом диапазоне, могут вызвать реверсию направления работы этих систем49). Действительно, в клетках клетчатки сома был показан обратный транспорт ГАМК наружу50). Таким образом, транспортные системы могут осуществлять не только закачку медиатора, но и его высвобождение. Реверсия механизма закачки медиатора может также иметь вредные последствия. Так, в результате травмы головного мозга или инсульта может произойти выброс глутамата из деполяризованных глиальных клеток, приводящий к накоплению токсичных концентраций этого медиатора во внеклеточной среде и дальнейшему повреждению соседних клеток 51).

Круговорот еще одного медиатора, ацетилхолина (ACh), происходит по несколько иной схеме. ACh синтезируется из холина и ацетил-кофермента А (глава 13). После высвобождения ACh в синаптическую щель его действие на постсинаптическую клетку ограничивается особым ферментом (ацетилхолинэстеразой; глава 9), которая гидролизует ACh на ацетат и холин. Приблизительно половина молекул холина закачивается в нервное окончание с помощью высокоаффинного (Кm = 2 мкмоль) механизма и используется для синтеза ACh. Подобно механизмам закачки моноаминов, ГAMK и глицина, этот механизм также зависит от внеклеточного натрия и хлора52).


 82                                      Раздел II. Передача информации в нервной системе

§ 6. Молекулярная структура переносчиков

До сих пор речь шла лишь о функциональных характеристиках переносчиков, без упоминания их молекулярного строения. Как и в случае ионных каналов (глава 2), каждая функциональная группа связана с определенной белковой молекулой или, в более общем виде, с семейством молекул. Многие из них удалось изолировать и клонировать, а также сделать предположение о конфигурации этих молекул в мембране. Ниже приведены обшие сведения о структуре молекул переносчиков, показанной на рис. 4.8. Большинство из них имеет от 10 до 12 трансмембранных сегментов и, как полагают, образует канало-подобные структуры. Перенос веществ через мембрану осуществляется путем попеременного выдвижения посадочных мест во внутриклеточную и внеклеточную среды.

АТФазы

Молекулярное строение натрий-калиевой АТФазы изучено достаточно детально 53, 54). Она состоит из двух субъединиц, и . -субъединица, молекулярная масса которой составляет приблизительно 100 кД, отвечает за ферментативную активность насоса и содержит все места связывания субстрата. Меньшая по размеру (35 кД) -субъединица содержит несколько внеклеточных мест гликозилирования и также необходима для функционирования насоса, однако в чем именно состоит ее роль, неизвестно. Обе субъединицы были успешно клонированы 55, 56). Предполагаемая структура показана на рис. 4.8А. Места связывания нуклеотидов и фосфорилирования расположены в большом цитоплазматическом участке -субъединицы, между четвертым и пятым трансмембранными сегментами. Большая часть -субъединицы расположена во внеклеточном пространстве, и лишь один сегмент предположительно пронизывает мембрану. Известны три изоформы -субъединицы (, 2 и 3), все они экспрессируются в нервной системе. Две из трех известных изоформ -субъединицы ( и β2) найдены в нервных тканях.

Семейство кальциевых АТФаз эндо- и саркоплазматического ретикулумов (SERCA) проистекает, как минимум, из трех генов с альтернативным сплайсингом15·57). Семейство кальциевых насосов плазматической мембраны (РМСА) является продуктом экспрессии четырех различных генов, каждый из которых имеет, как минимум, два варианта сплайсинга. Все эти белковые молекулы представляют собой одиночную полипептидную цепочку с молекулярной массой порядка 100 кД, структура которой напоминает -субъединицу натрий-калиевой АТФазы с увеличенным цитоплазматическим сегментом со стороны карбоксильного окончания. В отличие от натрий-калиевой АТФазы, эти АТФазы не нуждаются в -субъединице для осуществления своей ферментативной активности.

Натрий-кальциевые обменники

Натрий-кальциевый обменник сердечной мышцы (NCX1) представляет собой белок с молекулярной массой около 120 кД, состоящий из 970 аминокислот 59). Второй тип, NCX2, был первоначально клонирован из мозга крысы. Оба клона обладают рядом изоформ сплайсинга 60). С помощью гидропатического анализа и исследований с использованием антител было показано, что обменники состоят из 11 трансмембранных сегментов и большой внутриклеточной петли, расположенной между 5-м и 6-м сегментами (см. рис. 4.8В) 61). Размер и масса RetX несколько больше: 1 199 аминокислот, 130 кД 62). Несмотря на то, что между RetX и NCX нет большого сходства аминокислотных последовательностей, их мембранная топология должна быть сходной, как показывает гидропатический анализ.

Переносчики других ионов

В мозге крысы были найдены калий-хлорные ко-переносчики (КСС1 и КСС2) 63· 64). Каждый из них состоит из 1100 аминокислот и имеет молекулярную массу 120 кД. На основании первичной структуры этих молекул можно заключить, что в них входят 12 трансмембранных сегментов, и что оба окончания (аминотерминаль и карбокситерминаль) расположены в цитоплазме (см. рис. 4.8С). Сходной структурой обладают молекулы обменников анионов (АЕ)65), а также семейство натрий-калий-хлорных ко-переносчикрв (NKCC)34).

Молекулы переносчиков нейромедиаторов

Сходство первичных аминокислотных последовательностей транспортных белков, про-


Глава 4. Транспорт через мембрану клетки                                                 83

Рис. 4.8. Предполагаемая молекулярная структура транспортных молекул. Многие транспортные молекулы были успешно клонированы, а их расположение в мембране известно из результатов гидропатического анализа. (А) Натрий-калиевая АТФаза состоит из -субъединицы, имеющей от 8 до 12 трансмембранных участков, и меньшей по размеру -субъединицы, пронизывающей мембрану лишь один раз. Кальциевые АТФазы имеют сходное строение. (В) Натрий-кальциевые обменники насчитывают 11 трансмембранных участков. (С) Калий-хлорные ко--транспортеры, молекулы анионных семенников, а также натрий-калий--хлорные транспортеры имеют 12 трансмембранных участков и похожую конфигурацию в мембране. (D) Суперсемейство транспортных молекул, обеспечивающих закачку моноаминов, ГАМК и глицина, характеризуется наличием 12 трансмембранных участков. (Е) Глутаматные транспортеры меньше по размеру (10 трансмембранных участков).

Fig. 4.8. Proposed Molecular Configurations of Transport Molecules. Various transport molecules have been cloned and their structure in the membrane deduced from hydropathy analyses. (A) Sodium-potassium ATPase consists of an a subunit with 8 to 10 transmembrane segments, and a smaller β subunit that spans the membrane only once. Calcium ATPases have a similar structure. (B) Sodium-calcium exchangers have 11 transmembrane segments. (C) Potassium-chloride cotransporters, anion exchange molecules, and sodium-potassium-chloride transporters all share the same membrane configuration, characterized by 12 transmembrane segments. (D) The superfamily of transporters for the uptake of monoammes, GABA, and glycine has a motif of 12 transmembrane segments. (E) Glutamate transport molecules are smaller, with 10 transmembrane segments.

изводящих закачку в нервное окончание норэпинефрина (NET), серотонина (SERT), дофамина (DAT), ГАМК (GAT) и глицина (GLYT), позволяет заключить, что все они происходят от одного суперсемейства генов 66). Переносчики моноаминов представляют особый интерес, поскольку именно они являются мишенью для многих наркотических веществ, включая кокаин и амфетамин, а также некоторых антидепрессантов (глава 13). Каждый член суперсемейства представлен несколькими изотипами. Белки имеют молекулярную массу от 80 до 100 кД и, как следует из гидропати-


84           _Раздел II. Передача информации в нервной системе_____________________

ческого анализа, состоят из 12 трансмембранных сегментов (рис. 4.8D). По первичной последовательности молекулу переносчика холина также можно отнести к этому суперсемейству 67).

В настоящее время изолировано пять белков, осуществляющих закачку глутамата 68). Они структурно отличаются от суперсемейства переносчиков моноаминов, ГАМК и глицина. Размер этих белков сравнительно невелик, от 500 до 600 аминокислот, при массе около 65 кД. Гидропатические данные свидетельствуют о наличии 10 трансмембранных сегментов (см. рис. 4.8Е).

Семейства белков, осуществляющих закачку моноаминов, глицина, ГАМК, глутамата и ацетилхолина в синаптические пузырьки, функционально отличаются тем, что зависят не от натриевых, а от протонных градиентов. Везикулярные переносчики моноаминов (VMAT1 и VMAT2) были клонированы раньше других, за ними последовал везикулярный переносчик ацетилхолина (VAChT) 38). Каждая из этих молекул включает в себя от 520 до 530 аминокислот и, судя по гидропатическим данным, состоит из 12 трансмембранных сегментов. Структура VMAT1 и VMAT2 совпадает на 65 %, a VAChT идентичен им на 40 %. Молекулы переносчиков ГАМК и глицина также были успешно клонированы 69, 70). Они структурно отличаются от переносчиков моноаминов и ACh и состоят всего из 10 трансмембранных сегментов.

§ 7. Роль механизмов транспорта

Как первичные, так и вторичные механизмы активного транспорта вносят постоянный вклад в поддержание клеточного гомеостаза, а также поставляют необходимые элементы для синаптической передачи. Тем не менее, этими простыми на первый взгляд процессами их роль в жизнедеятельности нервной системы не ограничивается. Переносчики вносят существенный вклад в работу сигнальных систем клетки. Так, например, в небольших ответвлениях нервных окончаний во время распространения потенциала действия, активация натрий-калиевых АТФаз вследствие накопления внутриклеточного натрия может вызвать блок проводимости (глава 15). Другой пример связан с активацией рецепторов ГАМКА, которые образуют хлорные каналы в мебране клетки (глава 3). В тех клетках, из которых переносчики выводят хлор наружу, внутриклеточные концентрации этого иона низки, и при открывании хлорных каналов ГАМКА-рецепторов хлор входит в клетку, вызывая гиперполяризацню мембранного потенциала. Напротив, в тех клетках, где преобладают переносчики ионов хлора из внеклеточного пространства в цитоплазму, внутриклеточный уровень хлора сравнительно высок, и открывание ГАМКА-каналов приводит к деполяризации за счет выхода хлора из клетки 37). Таким образом, характер действия медиатора непосредственно определяется наличием тех или иных переносчиков в клетке.

Еще более важную роль играют переносчики нейромедиаторов. Быстрое удаление молекул медиатора из синаптической шели может предотвратить избыточную активацию, а также инактивацию рецепторов. Своевременная закачка медиатора в синаптические пузырьки поддерживает нервное окончание в состоянии постоянной готовности. Следовательно, переносчики выполняют важнейшую функцию регуляции динамических свойств синапсов и нервной системы в целом.

Вообще говоря, следует рассматривать ионные каналы как системы, проводящие электрические сигналы, а переносчики — как системы обеспечения базовых условий, при которых такое проведение становится возможным. Следует отметить, что между этими двумя системами зачастую происходят и более сложные взаимодействия, влияющие на работу нервной системы.

Выводы

∙  Перенос различных веществ через мембрану в клетку или из клетки производится целым рядом мембранных белков. Один из примеров — натрий-калиевый обменник, переносящий три иона натрия наружу и два иона калия внутрь клетки за счет энергии гидролиза одной молекулы АТФ. Обменник поддерживает внутриклеточную концентрацию натрия и калия на постоянном уровне, несмотря на утечку обоих ионов.

∙  Низкий уровень внутриклеточного кальция поддерживается двумя типами кальциевых АТФаз. АТФаза первого типа, расположенная  в  плазматической  мембране, осуществляет вывод кальция из клетки. Второй тип находится в мембранах


Глава 4. Транспорт через мембрану клетки                                                 85

эндо- или саркоплазматического ретикулума и обеспечивает откачку кальция из цитоплазмы во внутриклеточные органеллы.

∙  Еще один механизм кальциевого транспорта — натрий-кальциевый обменник. Энергия, получаемая от перемещения натрия внутрь клетки, т. е. в направлении его электрохимического градиента, затрачивается  на  вывод  ионов  кальция  наружу.  Это пример вторичного переносчика,  работа  которого · зависит от поддержания натриевого градиента натрий--калиевой АТФазой. В большинстве нейронов перенос одного иона кальция происходит за счет входа в клетку трех ионов натрия. При некоторых физиологических условиях натрий-кальциевый обменник может работать в противоположном направлении. В палочках сетчатки транспортная  молекула  переносит один  нон кальция и один ион калия в обмен на четыре иона натрия, входящих в клетку.

∙  Существует два основных типа молекул, осуществляющих вывод хлора из клетки. Первый — хлор-бикарбонатный обменник, играющий также важную роль в регуляции внутриклеточного рН и зависящий от электрохимического градиента натрия. Второй — калий-хлорный ко-переносчик, работа которого основана на перемещении калия из клетки наружу, т. е. в направлении его электрохимического градиента.

В некоторых типах клеток хлор не выводится наружу, а наоборот, аккумулируется в клетке. Этот процесс зависит от натриевого градиента и сопровождается входом в клетку ионов калия.

∙  В пресинаптических нервных окончаниях перемещение молекул медиатора в синаптические пузырьки происходит в обмен на выход из них протонов. Протонный градиент на везикулярной мембране поддерживается водородными АТФазами.

∙  После выброса в синаптическую щель молекулы медиатора закачиваются обратно при помощи систем вторичного транспорта, которые зависят от электрохимического градиента натрия. Существует два типа систем закачки медиатора: система, в которой перенос глутамата связан с входом натрия и выходом калия, и системы закачки других медиаторов, связанной с входом в клетку ионов натрия и хлора.

∙  Для   большинства  переносчиков  последовательность образующих их аминокислот известна, а гидропатический анализ позволяет сделать предположения об их конформации  в  мембране  клетки.   Как правило, молекулы переносчиков состоят из 10-12 трансмембранных участков и, по-видимому, образуют канало-подобные структуры, перенос веществ через которые осуществляется путем попеременного выдвижения посадочных мест во внутриклеточную и внеклеточную среды.

Рекомендуемая литература

о Altamirano, Α. Α., and Russell, J. M. 1987. Coupled

Na/K/Cl efflux. "Reverse" unidirectional fluxes in

squid giant axons. /. Gen. Physlol. 89: 669-686. о Baker, P. F, Hodgkin, A. L., and Ridgeway, Ε. Β.

1971. Depolarization and calcium entry in squid

giant axons. /. Physiol. 218: 709-755. о Kanner, B.I. 1994. Sodium-coupled neurotransmit-

ter transport: Structure, function and regulation. J.

Exp. Biol. [96: 237-249. о Schatzmann, H. J. 1989. The calcium pump of the

surface membrane of the sarcoplasmic reticulum.

Ann. Rev. Physiol. 51: 473-485. о Schnetkamp, P. P. 1995. Calcium homeostasis in

vertebrate retinal rod outer segments. Cell Calcium

18: 322-330.

о Schuldiner, S., Shirvan, A., and Linial, M. 1995. Vesicular neurotransmitter transporters: From bacteria to humans. Physiol. Rev. 75: 369-392.

о Simpson, P. В., Challiss, R. A. J., and Nahorski, S. R. 1995. Neuronal Ca2+ stores: Activation and function. Trends Neurosci. 18: 299-306.

о Skou, J. C. 1988. Overview: The Na.K pump. Methods Enzymol. 156: 1-25.

о Thomas, R. C. 1969. Membrane currents and in-tracellular sodium changes in a snail neurone during extrusion of injected sodium. /. Physiol. 201: 495-514.


86                                       Раздел II. Передача информации в нервной системе

Цитированная литература

1.   Hodgkin, A. L., and Keynes, R. D. 1955. J. Physiol. 128: 28-60.

2.   Caldwell,   P. Cet  al.   1960.  J.   Physiol.   152: 561-590.

3.   Skou,  J. C.   1957.   Biochim.   Biophys. Acta  23: 394-401.

4.   Skou, J.C. 1988. Methods Enzymol. 156: 1-25.

5.   Baker, P.P., et al. 1969. J. Physiol. 200: 459-496.

6.  Thomas, R.C. 1969. J. Physiol. 201: 495-514.

7.  Thomas, R.C. 1972. J. Physiol. 220: 55-71.

8.   Simpson, P. В., Challjss, R. A. J., and Nahorski, S. R. 1995. Trends Neurosci. 18: 299-306.

9.   Babcock, D. F., et al.  1997. J. Cell ВЫ136: 833-844.

10.   Baker, P.P., Hodgkin, A. L, and Ridgeway, E.B. 1971. J. Physiol. 218: 709-755.

11.   Tsien, R.Y. 1988. Trends Neurosci. 11:419-424.

12.   Miyawaki, A., et al. 1997. Nature 388: 882-887.

13.   Persechini, A., Lynch, J. A., and Romoser, V. A. 1997. Cell Calcium 22: 209-216.

14.   Golovina, V. A., and Blaustein, M. P. 1997. Science 275: 1643-1648.

15.   Edes, I., and Kranias, E.G. 1995. In Cell Physiology Source Book. Academic Press, New York, pp. 156-165.

16.   Schatzmann, H.J. 1989. Annu. Rev. Physiol. 51: 473-485.

17.   Carafoli, E. 1994. FASEBJ. 8: 993-1002.

18.   DiPolo, R., and Beaugé, L. 1979. Nature 278: 271-273.

19.   Reuter, H., and Seitz, N. 1968. J. Physiol. 195: 451-470.

20.   Baker, P. P., and Blaustein, M. P. 1968. Biochim. Biophys. Acta 150: 167-179.

21.   Baker, P. P., et al. 1969. J. Physiol. 200: 431-458.

22.   Caputo, C., Bezamlla, P., and DiPolo, R. 1989. Biochim. Biophys. Acta 986: 250-256.

23.   Rasgado-Flores, H., Santiago, E. M., and Blaustein, M.P. 1989. J.Gen. Physiol. 93: 1219-1241.

24.   Philipson, K. D., et al. 1996. Ann. N. Y. Acad Sci. 779: 20-28.

25.   LeBlanc, N., and Hume, J. R. 1990. Science 248: 372-376.

26.   Lipp, P., and Niggli, E.  1994. J. Physiol. 474: 439-446.

27.   Bridge, J. H. В., Smolley, J. R., and Spitzer, K. W. 1990. Science 248: 376-378.

28.   Schnetkamp, P. P., Basu, D. K., and Szerencsei, R.T. 1989. Am. J. Physiol. 257: C153-C157.

29.   Cervetto, L., et al. 1989. Nature 337: 740-743.

30.   Schnetkamp, P.P. 1995. Cell Calcium 18: 322-330.

31.   Inagaki, С, Нага, M., and Zeng, H.T. 1996. /. Exp. Zoo/. 275: 262-268.

32.  Thomas, R.C. 1977. J. Physiol. 273: 317-338.

33.   Payne, J.A. 1997. Am. J. Physiol. 273: C1516-C1525.

34.   Kaplan, M. R., et al. 1996. Annu. Rev. Physiol. 58: 649-668.

35.   Russell, J. M. 1983. J. Gen. Physiol. 81: 909-925.

36.  Altamirano, A. A., and Russell, J. M. 1987. /. Gen. Physiol. 89: 669-686.

37.   Rohrbough, J., and Spitzer, N. C. 1996. J. Neurosci. 16: 82-91.

38.   Schuldiner, S., Shirvan, A., and Linial, M. 1995. Physiol. Rev. 75: 369-392.

39.  Varoqui, H., and Erickson, J. D. 1997. Mol. Neu-robiol. 15: 165-191.

40.   Schuldiner, S., Steiner-Mordoch, S., and Yelin, R. 1998. Adv. Pharmacol. 42: 223-227.

41.   Hartinger, J., and Jahn, R. 1993. J. Biol. Chem. 268: 23122-23127.

42.   Barbour, В., et al. 1994. Neuron 12: 1331-1343.

43.  Tong,  G.,  and Jahr,  С. Е.   1994.  Neuron  13: 1195-1203.

44.   Kanner, B. I. 1994. J. Exp. Biol. 196: 237-249.

45.   Kanai, Y. 1997. Curr. Opin. Cell Biol. 4: 565-572.

46.   Bouvier, M., et al. 1992. Nature 360: 471-474.

47.   Hediger, M.A., et al. 1995. J. Physiol. 482P: 7S-17S.

48.   Mager, S., et al. 1996. /. Neurosci. 16: 5405-5414.

49.  Attwell, D., Barbour, В., and Szatkowski, M. 1993. Neuron 11:401-407.

50.   Cammack, J. N., and Schwartz, E. A.  1993. J. Physiol. 472: 81-102.

51.  Takahashi, M., et al.  1997. J. Exp. Biol. 200: 401-409.

52.   Cooper, J. R., Bloom, F. E., and Roth, R. H. (eds.). 1996. The Biochemical Basis of Neuropharmacology. Oxford University Press, New York, pp. 194-225.

53.   Pressley, T. A. 1996. Miner. Electrolyte Metab. 22: 264-271.

54.   Chow, D. C., and Forte, J. G. 1995. J. Exp. Biol. 198: 1-17.

55.   Kawakami, K., et al. 1985. Nature 316: 733-736.

56.   Noguchi, S., et al. 1986. FEBS Lett. 196: 315-320.

57.  Anderson, J. P., and Vilsen, B. 1995. FEBS Lett. 359: 101-106.

58.   Filoteo, A. G., et al. 1997. J. Biol. Chem. 272: 23741-23747.

59.   Nicoll, D.A., Longoni, S., and Philipson, K. D. 1990. Science 250: 562-565.

60.   Philipson, K. D., et al. 1996. Ann. N. Y. Acad. Sci. 779: 20-28.

61.   Cook, О., Low, W., and Rahamimoff, H. 1998. Biochim. Biophys. Acta 1371: 40-52.

62.   Reilënder, H., et al. 1992. EMBOJ. 11:1689-1695.

63.   Payne, J. A., Stevenson, T. J., and Donaldson, L. F. 1996. J.Biol. Chem. 271: 16245-16252.


Глава 4. Транспорт через мембрану клетки                                              87

64.   Gillen,  С.,  et  al.   1996.  J.   Вiоl.  Chem271: 16237-16244.

65.  Alper, S. L. 1991. Annu. Rev. Physiol. 53: 549-564.

66.  Nelson, N.. and Lill, H. 1994. J. Exp. ВЫ. 196: 213-228.